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放射联合基因治疗肿瘤相关性p53突变子实验研究

专 业: 放射医学
关键词: p53突变子 175H 基因沉默 电离辐射 RNAi H1299
分类号: R73
形 态: 共 63 页 约 41,265 个字 约 1.974 M内容
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内容摘要


p53基因是一种重要的抑癌基因,在细胞周期调控、DNA损伤修复、细胞凋亡及抑制肿瘤的发生等方面发挥着重要的作用。

人类肿瘤的发生与p53基因的突变有着密切的联系,人类50以上的肿瘤发生伴随着p53基因的突变,其中74是错义突变,而且p53基因的突变与病情的发展,肿瘤的转移以及对放疗、化疗的敏感性和预后都密切相关。

有研究表明,大多数的突变型p53可以与p53的靶基因启动子结合而抑制野生型p53的功能,突变的p53对野生型p53有显著的负效应,并且部分突变的p53有内在的致癌特性。

如何封闭肿瘤相关性p53杂合突变成为突破口和关键,为肿瘤的基因治疗提供了新思路。

本实验主要应用RNA干扰(RNA interference,即RNAi)原理,研究特异性发夹环RNA(Small hairpin RNA,shRNA)对突变型p53(mtp53)的沉默效果以及联合应用放射治疗对shRNA发挥干扰效果的影响。

RNAi是生物体内固有的机制,即在转录后水平进行基因沉默。

RNAi具有高效、特异性强的特点,应用于治疗可以回避其他基因治疗的缺点和不确定性。

实验选取与中国人肿瘤发生密切相关的p53突变子175H为研究对象,采取..……

全文目录


内容提要
前言
第一章 文献综述
1 p53基因的结构
2 p53的功能
2.1 G1、G2期阻滞
2.2 DNA修复
2.3 细胞死亡
3 p53的靶基因及调控p53的基因
3.1 p53的靶基因
3.2 调控p53的基因
4 p53基因与肿瘤
4.1 wtp53抗肿瘤的作用机制
4.2 肿瘤相关性p53基因突变
4.3 p53基因突变分类
5 肿瘤p53基因治疗
5.1 肿瘤的p53基因治疗
5.2 RNAi技术
6 肿瘤放射联合p53基因治疗
7 本课题研究的意义及前景展望
第二章 材料与方法
1 主要试剂及器材
1.1 试剂
1.2 器材
1.3 主要仪器
2 细胞株培养
2.1 细胞株
2.2 细胞培养试剂的配制
2.3 细胞冻存及复苏
3 表达载体的构建
3.1 试剂配制
3.2 突变子表达载体构建
3.3 shRNA表达载体的构建
4 突变子细胞模型的建立
5 突变子基因沉默
5.1 试剂的配制
5.2 磷酸钙共沉淀法转染
6 蛋白质免疫印记法(Western Blot)
6.1 试剂的配制
6.2 总蛋白提取
6.3 蛋白浓度测定—标准曲线法
6.4 Western Blot
7 照射条件
第三章 实验结果
1 突变子175H表达载体的构建
1.1 基因定点突变
1.2 载体线性化回收
1.3 载体连接和扩增
1.4 pcDNA3.1-175H测序结果
2 Psuper-175HR载体构建
2.1 psuper.retro.puro载体的线性化
2.2 Psuper-175HR载体构建
3 突变子细胞模型和基因沉默检测
3.1 突变子细胞模型构建
3.2 基因沉默检测
4 突变子细胞模型时程影响
5 突变子细胞模型量效影响
6 突变子细胞模型基因沉默后时程影响
第四章 讨论
第五章 结论
参考文献
中文摘要

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中图分类: > R73 > 医药、卫生 > 肿瘤学

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