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短小芽胞杆菌脂肪酶YZ02的定向进化研究

专 业: 微生物学
关键词: 短小芽胞杆菌 脂肪酶 定向进化 易错PCR 筛选
分类号: Q939.124
形 态: 共 66 页 约 43,230 个字 约 2.068 M内容
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内容摘要


定向进化是蛋白质工程的新策略,属于蛋白质的非理性设计。

它不需事先了解酶的空间结构和催化机理,而是人为地创造特殊的进化条件,模拟自然进化机制,在体外改造酶分子结构并定向选择出具有目的性状的改良酶。

常用的进化策略包括易错PCR、交错延伸重组和DNA改组等。

以本实验室自主克隆到的短小芽胞杆菌脂肪酶YZ02基因为材料,利用易错PCR技术对其开展了体外定向进化研究。

共进行了两轮易错PCR,每轮约筛选6000个转化子。

共筛选出4株酶活力提高2倍以上的突变体,其中一株突变体BpL2-1369酶活力提高了6倍。

测序结果显示,BpL2-1369脂肪酶基因有4个碱基发生了突变,即:T61C、C147T、A334G和T371A。

其中3个碱基突变导致了氨基酸发生改变,分别为第21位氨基酸由Ser突变为Pro,第112位氨基酸由Arg突变为Gly,第124位氨基酸由Leu突变为His。

在两轮易错PCR的基础上,进行了一轮交错延伸重组,但未能筛选到酶活力有进一步提高的重组体。

将野生型脂肪酶BpL基因和定向进化后的脂肪酶BpL2-1369基因分别克隆至pET28-a载体,转化大肠杆菌BL21感受态细胞。

经IPTG诱导表..……

全文目录


摘要
1 文献综述
1.1 脂肪酶简介
1.2 脂肪酶催化反应类型和催化机理
1.3 脂肪酶的水解特异性
1.4 脂肪酶的结构
1.5 酶的定向进化
1.6 脂肪酶的应用
1.7 本研究的目的及意义
2 材料与试剂
2.1 主要仪器
2.2 菌种和质粒
2.3 酶与试剂
2.4 培养基
2.5 溶液
3 研究方法
3.1 质粒的提取
3.2 易错PCR 扩增反应
3.3 高效感受态制备
3.4 T 载体连接
3.5 转化
3.6 阳性克隆的筛选
3.7 阳性克隆的鉴定
3.8 交错延伸重组
3.9 短小芽胞杆菌脂肪酶的表达和分离纯化
3.10 蛋白质含量测定
3.11 野生脂肪酶和突变脂肪酶的酶学性质比较
3.12 脂肪酶结构预测和突变位点分析
4 结果与分析
4.1 易错PCR
4.2 突变体的筛选和酶切鉴定
4.3 突变基因的序列测定
4.4 脂肪酶的诱导表达和分离纯化
4.5 突变脂肪酶和野生型脂肪酶的酶学性质比较
4.6 短小芽胞杆菌脂肪酶的结构预测
5 讨论
5.1 定向进化策略
5.2 突变率与突变库的大小
5.3 正向突变间的叠加问题
5.4 筛选策略
5.5 突变效应
6 小结和展望
6.1 全文小结
6.2 展望
参考文献

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中图分类: > Q939.124 > 生物科学 > 微生物学 > 微生物分类学(系统微生物学)

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