优秀研究生学位论文题录展示

番茄叶片GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因(GMPase)的cDNA克隆及功能分析

专 业: 蔬菜学
关键词: GDP-甘露糖焦磷酸化酶 抗坏血酸 抑制表达 温度胁迫 烟草 转基因
分类号: S601  S641.2
形 态: 共 87 页 约 56,985 个字 约 2.726 M内容
阅 读: 全文阅读说明

内容摘要


维生素C又称抗坏血酸(AsA),是一种普遍存在于植物组织的高丰度小分子抗氧化物质(Asada and Takahashi,1987),在植物抵抗氧化胁迫中具有重要作用,它可以与单线态氧(O<,2><1>)、超氧自由基(O<,2><->)、过氧化氢(H<,2>O<,2>)和羟自由基(HO<->)等活性氧反应,保持维生素E的还原状态(Asada,1994),并可做为抗坏血酸过氧化物酶的底物(Conklinet al.,1996,1997;Noctor and Foyer,1998;Sminloff,2000;Sanmartin et al.,2003)。

植物中AsA的重要性不仅在于它在植物抵抗氧化胁迫中具有重要作用,而且近年来的研究发现,AsA对于光合作用和光保护、细胞的生长和分裂以及一些重要次生代谢物和乙烯的合成等诸多方面起着非常重要的生理功能。

GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GMPase)是植物AsA生物合成途径的第一个关键酶,其催化所得产物GDP-甘露糖也用于细胞壁碳水化合物的合成和蛋白糖基化。

GMPase对提高植物体内AsA含量,增强植物的抗胁迫能力具有非常重要的作用。

本研究从番茄叶片中克隆到GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因,研究了在温度逆境下该基因在番茄各器官中转录水平的表达,然后将构建的该基因正义和反义表达载体用农杆菌介导法导入烟草植株和马铃薯植株中,研究其在烟草和马铃薯体内的功能及表达,并进一步研究了转反义基因烟草抗坏血酸含量和在高温和低温度逆境下抗氧化系统的变化,主要结果如下:

1.利用同源序列设计简并引物,通过RT-PCR的方法从番茄叶片克隆到GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因的中间片段,再通过5’-RACE和3’-RACE分别克隆到5’片段和3’片段,拼接后设计特异引物扩增到全长1402 bp cDNA,ORF为1083 bp,编码361个氨基酸的多肽,分子量约为43 kDa。

同源序列比较发现,番茄GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因序列与马铃薯、烟草、紫花苜蓿、拟南芥的GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因的序列高度同源,因此推断我们获得的全长cDNA.编码的产物是GDP-甘露糖焦磷酸化酶,该基因命名为GMPase。

聚类分析也表明GMPase与马铃薯、烟草、紫花苜蓿、拟南芥的GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因的亲缘关系很近。

2.Northern 杂交结果表明,GMPase基因在番茄不同器官中呈非特异性表达,以叶片中表达水平最高,其次为果实,茎、根中表达量最少。

其表达水平在48h内随温度胁迫处理时间的延长而增加,但3h时其表达较低,说明GMPase的表达受温度胁迫诱导。

3.将获得的GMPase基因与含有35S启动子的pBI121载体重组,分别构建了正义和反义表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,用PCR及Northern杂交的方法对带卡那抗性的转基因烟草植株进一步检测,结果证明成功地获得了转正义和反义基因的烟草植株及转正义基因的马铃薯植株。

4.在转反义GMPase基因烟草中抑制了GMPase基因的表达,GMPase特异探针标记的Northern杂交结果表明GMPase基因在转反义GMPase基因烟草中在常温和温度胁迫条件下均不表达,而野生烟草中GMPase基因表达水平在48小时内随温度胁迫处理时间的延长而增加,但3h时其表达较低,结果与野生番茄相同。

5.构建了原核表达载体pET-GMPase,并在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白,将强诱导带切下,溶于PBS获得抗原,免疫小白鼠,其抗血清效价为 1∶500。

Western杂交表明,转正义烟草植株中GMPase基因已在蛋白水平过量表达,转反义烟草植株中GMPase基因表达被抑制。

6.与野生型烟草相比,转反义烟草叶片抗坏血酸含量降低30%-40%,表现出与野生烟草不同的表型。

转反义基因植株在组织培养过程就开始开花,且所有转反义基因植株在7—8片叶时均开始开花,而野生烟草没有出现这种现象,当其生长至 25-28叶时才开始开花,转反义GMPase基因烟草开花时间比野生烟草提前近2个月。

此外,在7-8叶时,转反义基因烟草的节间显著长于野生烟草且叶片较薄、较小,并出现早衰的现象。

7.GMPase基因的抑制表达明显降低了转反义基因烟草的抗氧化能力,具体表现为在低温(4℃)和高温(40℃)胁迫下,转反义GMPase基因烟草叶片的SOD、APX和CAT活性明显低于野生烟草,而其叶片MDA和H<,2>O<,2>含量则正好相反,大大高于野生烟草。

8.上述研究结果充分证明了GMPase基因在植物抗坏血酸生物合成中的关键作用。

尽管GMPase并非清除活性氧的抗氧化酶,但是GMPase基因的表达却与作物的抗氧化能力密切相关..……

全文目录


论文说明:英文缩写符号及其中英文对照
中文摘要
英文摘要
1引言
1.1课题的提出
1.2AsA研究进展
1.2.1高等植物中AsA的合成与代谢
1.2.2植物抗坏血酸的转运
1.2.3 AsA在植物体内的生理功能
1.3植物AsA合成代谢关键酶的研究进展
1.3.1 GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GMPase)的研究进展
1.3.2 L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶(GalLDH)的研究进展
1.3.3脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)的研究进展
1.3.4抗坏血酸过氧化物酶(APX)的研究进展
1.3.5抗坏血酸氧化物酶(AAO)的研究进展
2材料与方法
2.1实验材料
2.1.1植物材料
2.1.2材料处理
2.1.3菌株与质粒
2.1.4酶与生化试剂
2.1.5PCR引物
2.2实验方法
2.2.1利用TRIZOL试剂盒提取RNA
2.2.2反转录cDNA第一条链的合成
2.2.3目的基因全长cDNA的分离
2.2.4 Northern杂交分析
2.2.5 GMPase基因正义表达载体的构建
2.2.6农杆菌介导转化烟草
2.2.7转基因烟草植株的PCR检测
2.2.8转反义基因烟草生理指标的测定
2.2.9 GMPase的原核表达及Western杂交
3结果与分析
3.1 GMPase的分离及其特征
3.1.1 GMPase中间片段的分离
3.1.2 GMPase基因全长的克隆
3.1.3 GMPase基因序列分析
3.2植物表达载体的构建
3.3番茄叶片GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因转化烟草及转基因植株的分子检测
3.4基因表达特性分析
3.4.1 GMPase基因在野生型番茄中的表达
3.4.2 GMPase基因在野生型和转反义基因烟草中的不同表达
3.4.3 pET-GMPase原核表达载体的构建和鉴定
3.4.4 GMPase蛋白的原核表达
3.5转反义基因烟草中的AsA含量
3.6温度胁迫下转反义基因烟草中H2O2和脂质过氧化物增加
3.7温度胁迫对WT和转反义基因烟草SOD、CAT和APX活性的影响
3.8反义介导的GMPase缺失引起烟草表型差异
4讨论
4.1 GMPase编码GDP-甘露糖焦磷酸化酶
4.2反义介导的GMPase的缺失导致转反义基因烟草叶片中的AsA含量降低
4.3反义介导的GMPase的缺失显著降低转反义基因烟草的耐温度胁迫性能
4.4反义介导的GMP的缺失影响烟草的开花
5结论
6下一步研究工作设想
参考文献
附录

相似论文

  1. 绿色荧光蛋白融合表达法研究黄瓜α-半乳糖苷酶亚细胞定位,59页,S601 S642.2
  2. 组培环境对构建芦荟再生植株影响的研究,67页,S601 Q945.39 S567.2
  3. 果菜类蔬菜根系限制下能量代谢变化及其调控机制,97页,S601
  4. CPPU诱导瓠瓜单性结实生理和分子生物学机制研究,79页,S601
  5. 大蒜微繁的一种新技术体系的构建,55页,S601 S633.4
  6. 大气压等离子体处理对蔬菜生长发育的影响,52页,S601
  7. 关于加工番茄综合评价体系的研究,48 页,S641.2
  8. 西红花玉米黄质裂解酶基因转化番茄的研究,62页,S641.2
  9. 番茄红素环化酶基因片段克隆的研究,56页,S641.2
  10. 果蔬产品及加工标准体系研究,122页,S609.2 TS255.3
  11. RAPD技术在苦瓜、辣椒一代杂种种子纯度鉴定上的应用研究,41页,S603.2
  12. 轮作方式对黄瓜根际细菌多样性及产量的影响,71页,S604.6 S642.2 S436.421
  13. 微加工蔬菜清洗与护色保鲜技术的研究,40页,S609.3
  14. 基质、肥水对有机生态型无土栽培韭菜生长和产量的影响,50页,S604.7 S633.3
  15. 不同水氮处理对露地叶菜硝酸盐积累与土壤氮淋失的影响,54页,S606.2 S63
  16. 不结球白菜离体不定芽的诱导及处理条件下其形态发生过程中生理生化特征的研究,79页,S603.2
  17. 不结球白菜自交不亲和基因的分子标记,55页,S603.2
  18. 室内无土栽培樱桃番茄农艺性状的比较研究,48页,S604.7 S641.2
  19. 不同耐贮性番茄果实成熟过程中生理特性差异的比较研究,51页,S603.2 S641.2
  20. 棉秆作为有机栽培基质原料的研究,51页,S604.7 S641.2
中图分类: > S601 > 农业科学 > 园艺 > 一般性问题 > 生物学原理
其他分类: > S641.2 > 农业科学 > 园艺 > 茄果类

© 2012 book.hzu.edu.cn