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深海细菌Shewanella piezotolerans WP3中DMSO厌氧呼吸系统及其调控机制的研究

专 业: 微生物学
关键词: Shewanella piezotolerans WP3 DMSO厌氧呼吸 DMSO还原酶 细菌呼吸
分类号: Q93
形 态: 共 67 页 约 43,885 个字 约 2.099 M内容
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内容摘要


细菌呼吸是自然界中一个最基本、最重要的生物代谢过程,具有很大灵活性和多样性,各种呼吸途径之间存在密切关系。

细菌DMSO还原作用不仅参与了全球的硫元素、铁元素的循环,还与全球气候的降温作用、雨水酸度、大气臭氧浓度变化有密切关系。

生活在深海环境下的极端微生物必然有特殊的生理代谢途径适应极端环境,在“全球生态系统”中扮演重要角色。

本文所研究的深海细菌分离自西太平洋1914米的深海沉积物中。

菌种鉴定为Shewanella piezotolerans WP3,它既是耐压菌,又是低温菌,现在已经完成其全基因组序列的测定,是研究极端微生物适应极端环境的理想材料。

以WP3为实验材料,结合生物信息学、各种分子生物学手段,对其DMSO厌氧系统的组成、转录表达和调控进行了一系列地分析,使我们对极端微生物独特的基因类型、特殊的代谢途径以及在深海环境中的作用有了更为深入的了解。

希瓦氏细菌广泛的分布在各种环境中,它们能够将DMSO还原为DMS进行厌氧生长。

通过对20株已完成全基因组测序的希瓦氏细菌的dms基因簇的比较,在希瓦氏菌中已发现五种类型的dms基因簇,其中10株具有typeⅠ dmsEFABGH。

相比较于typeⅠ型的dms基因簇,typeⅡ型和typeⅢ型的则多含了一个编码外膜脂蛋白的基因;typeⅣ型多含有一个不同的基因,编码与核酸内切酶相关的蛋白质;typeⅤ型含有dmsC基因,其排序与E.coli中的很相似,缺少编码DmsEF(类似于MtrAB)的基因,DMSO还原酶位于细胞周质,由DmsC锚定在内膜上[1]。

在WP3中,除了找到了希瓦氏菌中已发现的五种类型之一的典型的dms基因簇类型typeⅠ dmsEFABGH外,还发现一种新的类型dms基因簇,即typeⅥ型dms基因簇,缺少dmsF基因,在dmsE与dmsA之间还存在两个属于LysR家族的转录调节基因,这两个调节基因的功能还未知。

WP3以DMSO进行厌氧生长时,typeⅥ型dms基因簇中的dmsA-2和dmsB-2明显高表达,typeⅠ dmsEFABGH也不是WP3进行DMSO厌氧呼吸所必需的,与MR-1中的情况正好相反。

对成功构建的dms基因单缺失突变株和双dmsB基因缺失突变体在4℃和20℃下进行表型生长检测,与野生菌株相比较,证明WP3中包含两种具有还原DMSO的功能的不同类型的dms基因簇。

当一种类型的dms基因簇中DMSO还原酶基因缺失后,另一种类型中DMSO还原酶基因就会增加转录量至原来的2-3倍,两种类型的基因簇的单独存在均能维持缺失菌体最大限度的利用DMSO进行厌氧生长,而与野生型WP3的厌氧生长没有什么差别。

WP3中DmsA经NCBI Blaste比对,DmsA-1与Shewanella sediminis HAW-EB3有最高同源性90%,Shewanella woodyi ATCC51980有89%的同源性;DmsA-2与Shewanella putrefaciens CN32有最高同源性61%,与Shewanella oneidensis MR-1有60%的同源性。

但是WP3中的DmsA-1和DmsA-2在一级结构的序列上相似性比较低,相比较其他菌株而言仅有53%,在同一菌株中具有同样的功能。

WP3不仅含有两种类型的dms基因簇,而且DMSO还原酶复合物中蛋白质的序列具有高度可变性,也很好的说明了希瓦氏菌对DMSO还原作用的灵活多样性。

在大肠杆菌中,Fnr和NarL的共同作用调节dmsABC基因的表达。

在厌氧条件下Fnr对dmsABC基因的表达起正调控作用;在硝酸盐存在的条件下,NarL对dmsABC基因的表达起负调控作用。

在MR-1中,EtrA(电子传递蛋白A)与Fnr同源性高达73.6%,却不是MR-1进行DMSO厌氧呼吸所必需的,与Fnr的调控作用有很大不同。

CRP在MR-1的厌氧呼吸中起到调控作用,MR-1的crp缺失突变体在以Fe(Ⅲ)、Mn(Ⅳ)、延胡索酸、硝酸盐、DMSO为单一终末电子受体培养时不能进行厌氧呼吸。

厌氧条件下,CRP的激活机制还不清楚,CRP缺少明显的感应氧化还原势的结构,不被认为可以感应氧化还原势的变化。

现在WP3中crp基因缺失突变株正在构建,所以crp基因与WP3厌氧呼吸是否有联系还不确定。

WP3中etrA基因(swp2580)与MR-1的同源性高达88%,已经成功构建了WP3中etrA基因的缺失突变体,测定了突变株△etrA对DMSO厌氧呼吸作用的影响。

与野生型菌株比较,突变株的生长状态没有什么变化,etrA对WP3还原DMSO的过程没有调控作用。

同时检测了WP3中etrA基因对含硫化合物的还原作用,在20℃下以硫代硫酸钠为电子受体进行厌氧生长时,突变株△etrA同样能够将硫代硫酸钠还原,与野生菌株没有差异。

WP3中etrA基因对其还原含硫化合物的过程并不起调控作用。

在研究fur基因(ferric uptake regulator)在WP3中的作用时,通过实验发现fur基因缺失突变菌株的一些厌氧呼吸受到了很大的影响,这其中包括对DMSO的还原作用。

在dms基因簇的附近没有找到Fur的DNA结合区域,通过本实验室孙坪同学对fur基因的研究,认为Fur影响了细胞色素C的成熟系统,使厌氧呼吸的电子传递链受到影响,间接影响了WP3对DMSO等多种电子受体的利用,fur基因并不启始dms基因簇的转录表达。

这也体现了细胞呼吸的调控是多基因在多个水平上共同作用的结果..……

全文目录


文摘
英文文摘
论文说明:缩写词表
第一章 前言
1深海微生物研究的概况
2微生物呼吸作用的多样性及其意义
2.1微生物呼吸作用的多样性
2.2微生物呼吸作用的重要意义
3微生物以DMSO为终末电子受体的厌氧呼吸的研究概况
3.1钼氧转移酶的分类
3.2古菌中DMSO厌氧呼吸机制的研究概况
3.3细菌的DMSO厌氧呼吸机制的研究概况
3.4 DMSO厌氧呼吸作用与环境关系的研究
第二章 深海细菌Shewanella piezotolerans WP3中DMSO厌氧呼吸系统及其调控机制的研究
1材料与方法
1.1材料
1.2方法
2结果与讨论
2.1希瓦氏菌中与DMSO厌氧呼吸相关的基因
2.2 WP3中dms基因共转录的研究
2.3 WP3中dms基因在厌氧条件下的表达变化
2.4 WP3中dms基因在DMSO厌氧呼吸中的作用
2.5不同浓度的DMSO对dms基因在厌氧条件下的转录水平的影响
2.6 WP3的DMSO厌氧呼吸作用的调控
2.7 DMSO还原酶A亚基的建树
第三章 总结与展望
参考文献
附录

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