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大鼠BMSCs的菲立磁标记及体外MR成像

专 业: 外科学
关键词: 肝硬化 菲立磁标记 磁共振成像 骨髓间质干细胞 细胞分化
分类号: R657.31
形 态: 共 44 页 约 28,820 个字 约 1.379 M内容
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内容摘要


肝硬化是一全球性常见病,是多种致病因素导致的严重肝脏疾病,疗效不佳。

在其防治研究过程中,糖皮质激素、抗TGF—β单克隆抗体或TGF—β受体抑制剂及干扰素等,均因疗效不确切或副作用太严重而被淘汰。

基因治疗由于载体安全问题未解决,目前尚不能临床应用。

肝细胞移植因移植后的肝细胞在体内存活和增殖十分困难,临床使用价值不大。

肝移植因费用高、供体缺乏、免疫排斥及生存期不理想等缺点,仅适用于终末期肝病,并不适用于所有肝硬化患者。

近年来,科学家对干细胞尤其是骨髓间质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)在肝病治疗方面的作用进行研究,显示出良好的应用前景。

研究表明,BMSCs具有多向分化潜能和强大的增殖能力,来源丰富,易于分离、培养、扩增和纯化,遗传背景稳定,是器官修复治疗中比较理想的种子细胞。

目前已经有大量的研究结果证实BMSCs在体外可以被诱导分化为肝样细胞,表达肝细胞表面标志并且具备分泌白蛋白、尿素以及合成并储存糖原等功能,因此认为BMSCs可能通过向肝细胞分化修复受损的肝细胞或替代部分肝细胞功能起到治疗作用。

另外也有研究发现BMSCs可以分泌多种细胞因子,并且通过细胞因子影响其他细胞,即旁分泌作用。

然而,无论是通过分化为肝细胞或旁分泌起作用,其前提必须是移植的BMSCs进入并定植在受损的肝脏。

因此,研究移植细胞在体内如何定植、迁移对揭示其作用机理十分重要。

研究移植细胞在体内定植、迁移首先涉及到如何将移植细胞与机体本身的细胞区分开来。

目前,除利用Y染色体这种天然的区分标记外,大多数需要对移植细胞进行体外标记。

现有的多种标记BMSCs方法如绿色荧光蛋白、BrdU以及荧光染料法均需要经过有创方法才能获得病理标本进行研究,不利于进行长时间的实时活体示踪。

有研究显示,使用菲立磁标记BMSCs可以通过MRI进行体内示踪,然而,菲立磁标记对于移植细胞的生物学特性、分化能力是否发生影响尚不确定,标记细胞传代过程中MR信号发生何种变化也不清楚,这些问题的回答对移植细胞示踪的研究和临床应用有重要意义。

为此,本课题使用菲立磁—鱼精蛋白(Feridex—protamine sulfate)标记Wistar大鼠BMSCs,研究标记后BMSCs的体外存活、扩增及向肝细胞分化能力的变化以及标记后各子代BMSCs的MRI信号变化,为BMSCs的体内示踪奠定基础。

第一章:菲立磁—鱼精蛋白标记Wistar大鼠BMSCs 1.目的 研究分离培养Wistar大鼠BMSCs的方法,并用Feridex—protamine sulfate标记,探讨该标记物对BMSCs增殖能力的影响。

2.材料与方法 采用贴壁法结合密度梯度离心法分离培养大鼠BMSCs,经过换液和传代,获得第3代(P3)细胞。

采用流式细胞仪技术检测P3 BMSC细胞表面标志表达情况。

用菲立磁标记P3 BMSCs,选择菲立磁终浓度为50μg\ml,标记后24小时分别采用台盼蓝排斥实验及流式细胞仪技术作细胞存活及凋亡分析,标记后48小时作细胞增殖动力学分析,换液传代至第6代,运用普鲁士蓝染色观察该标记在细胞中存留的情况。

3.结果 采用贴壁法结合密度梯度离心法分离培养大鼠BMSCs原代48小时可观察到克隆形成,6-8天集落几乎铺满瓶底,经过换液及传代,第3代可获得较纯化的BMSCs:

CD34-、CD45-、CD29+、CD44+、CD105+、CD166+。

采用菲立磁终浓度为50μg\ml的Feridex—protamine sulfate标记P3 BMSCs,标记后24小时、48小时的台盼蓝拒染率、凋亡率及生长曲线均与未标记BMSCs无差别,普鲁士兰染色见90%~100%的标记BMSCs胞浆内含有大量的蓝色颗粒,传至第6代后50%的MSCs胞浆内仍见到蓝色颗粒。

4.结论 (1)贴壁法结合密度梯度离心法,方法简便,分离到的细胞纯度高,诱导后分化均匀。

(2)采用菲立磁终浓度为50μg\ml的Feridex—protamine sulfate标记BMSCs,有较高的标记效率,进入细胞内的菲立磁随着传代不均匀地分配到子代细胞,经过6次传代仍然可以检测到标记物。

(3)菲立磁标记不会影响BMSCs的增殖能力。

第二章:菲立磁—鱼精蛋白标记BMSCs诱导成为肝细胞 1.目的 研究菲立磁标记对BMSCs向肝细胞分化能力的影响。

2.材料与方法 取标记后24h的BMSCs分为A、B两组,A组培养液中加入2%急性肝衰竭大鼠肝脏匀浆上清液和10 ng\ml bFGF进行诱导,B组不加诱导剂,取未经标记的P3 BMSCs按A组方法诱导作为对照组,经过换液及传代,在培养的第1、3、7、14、21、28d检测甲胎蛋白和细胞角蛋白的表达。

诱导2周后运用高碘酸—希夫染色法检测糖原。

诱导过程换液时收集培养液,酶联免疫吸附测定法检测分泌到培养液中的白蛋白浓度,并与培养液、成熟大鼠肝细胞培养液中的白蛋白浓度作对比。

诱导过程换液时收集培养瓶上清液并保存、集中,利用全自动生化仪测定收集液中尿素含量,将不同时点的尿素含量进行对照分析。

3.结果 BMSCs诱导培养8d后AFP免疫细胞化学染色呈阳性,16d后CK18免疫化学染色呈阳性,Feridex—protamine sulfate标记组与对照组结果相似,未经诱导BMSCs的AFP、CK18免疫化学染色均为阴性。

诱导培养18d后,细胞PAS染色可见胞浆内存在红色颗粒(PAS染色阳性反应),显示细胞有糖原合成和贮存功能,标记组与对照组结果相似。

DMEM培养液与非诱导组均未检测出尿素,诱导培养15d后培养液尿素浓度呈现逐渐升高,21天后与成熟肝细胞结果接近,差异无统计学意义(P=0.15),标记组与对照组间差异无统计学意义(P=0.37)。

空白培养液与非诱导组均未检测出白蛋白,诱导15d后检测到培养液中白蛋白浓度逐渐升高,标记组与对照组间差异无统计学意义(P=0.29);两诱导组白蛋白的浓度显著低于成熟肝细胞组(分别为P=0.0014和0.0011)。

4.结论 采用菲立磁终浓度为50μg\ml的Feridex—protamine sulfate标记BMSCs不影响其向肝细胞诱导分化能力。

第三章:菲立磁—鱼精蛋白标记BMSCs标记的体外MR成像 1.目的 寻找菲立磁标记细胞的体外磁共振成像敏感序列。

2.材料与方法 取标记后24h、48h及传代后BMSCs细胞样本,采用火焰原子分光光度法测量细胞内铁含量。

另外制作获得的标记后24h、48h以及传代后BMSCs的固定标本,并进行T1WI、T2WI和T2*WI序列扫描,观察信号变化规律并获得不同成像序列的信号强度平均值。

3.结果 菲立磁标记的BMSCs发生分裂传代时标记物不均匀地分布到子代细胞内,经过多次传代后细胞内的菲立磁浓度不断下降。

MRI显示菲立磁标记24h、48h或各子代的BMSCs标本T1WI、T2WI以及T2*WI三个序列上均可见信号降低,以T2*WI变化最为明显;标记24h、48h比较,标记48h的信号低于标记24h;尽管随着传代次数增加MRI信号降低的程度逐渐减弱,但是传至第4代的MR成像与未标记组比较,T2*WI序列仍可见明显区别。

根据MRI信号测量数据计算出菲立磁标记BMSCs24h后第1~4代标本在不同成像序列的信号强度平均值,统计结果显示T1WI序列中标记后MR信号与未标记组无统计学差异,T2WI序列中标记后第1~2代与未标记组有统计学差异,T2*WI序列中标记后第1~4代均与未标记组有统计学差异,但标记后第1~4代间两两比较差异无统计学意义(P>0.05)。

计算结果与肉眼阅读MR片结果吻合。

4.结论 T2*WI为MRI检测菲立磁标记BMSCs的敏感序列..……

全文目录


文摘
英文文摘
前言
第一章 菲立磁—鱼精蛋白标记Wistar大鼠BMSCs
1.材料与方法
2.结果
3.讨论
4.结论
第二章 菲立磁—鱼精蛋白标记BMSCs诱导成为肝细胞
1.材料与方法
2.结果
3.讨论
4.结论
第三章 菲立磁—鱼精蛋白标记BMSCs标本的体外MR成像
1.材料与方法
2.结果
3.讨论
4.结论
全文总结
展望
参考文献
附录缩略词汇中英对照表

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