优秀研究生学位论文题录展示

胶质细胞在吗啡镇痛耐受和ATP代谢中的作用

专 业: 生理学
关键词: 胶质细胞 吗啡 镇痛耐受 吗啡耐受 免疫组织化学 动物模型
分类号: R971.1
形 态: 共 110 页 约 72,050 个字 约 3.446 M内容
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内容摘要


本研究拟进行以下四个方面的研究:

(1)探讨脊髓小胶质细胞p38MAPK在吗啡耐受中的作用是否受nNOS调制;(2)探讨脊髓星型胶质细胞JNK在吗啡耐受中的作用;(3)探讨脊髓星型胶质细胞JNK在吗啡耐受中的作用是否受NMDA受体调制;(4)以各种细胞为研究对象,首先比较神经元和胶质细胞在ATP代谢中的作用,再进一步明确各种胶质细胞在ATP代谢的每个过程中所发挥的具体作用。

探讨正常情况下不同胶质细胞在ATP代谢中的具体作用,有助于进一步探讨胶质细胞及ATP与其代谢物在吗啡耐受或其他病理情况中的作用。

第一章脊髓小胶质细胞p38MAPK在nNOS介导的吗啡耐受中的作用 为了探讨脊髓小胶质细胞p38MAPK在吗啡耐受中的作用是否受nNOS的调制,本实验使用了nNOS的特异性抑制剂7-NINA。

实验中通过对SD大鼠连续7天鞘内注射吗啡15μg建立吗啡耐受的动物模型,用50℃热水甩尾法观察吗啡的镇痛效果。

结果显示,慢性鞘内注射吗啡7天后,吗啡镇痛作用明显下降,表明吗啡耐受的形成;7-NINA(25μg)本身对痛阈无影响,但联合应用7-NINA和吗啡,能够延缓吗啡耐受的形成。

结果提示nNOS包括其产生的NO参与形成吗啡耐受。

为了证实我们的设想,用免疫组织化学染色观察脊髓小胶质细胞的标记物OX-42和磷酸化p38(p-p38)的表达。

结果显示,吗啡耐受组脊髓OX-42表达明显上调,而且小胶质细胞的胞体变圆,突起变粗,成阿米巴状,提示慢性吗啡处理能激活脊髓小胶质细胞;而联合应用7-NINA和吗啡后,OX-42的表达受到了抑制,形态改变也较单纯吗啡组减轻,提示nNOS可能介导慢性吗啡处理对脊髓小胶质细胞的激活。

同时,p-p38免疫染色结果表明,吗啡耐受导致的p-p38只存在于小胶质细胞,而且7-NINA+吗啡组的p-p38阳性细胞数量较单纯吗啡组明显减少,提示7-NINA抑制了脊髓小胶质细胞内p-p38的表达。

值得注意的是nNOS只存在于神经元,OX-42是小胶质细胞的标记物,p-p38特异性地表达于小胶质细胞,提示在吗啡耐受的形成过程中,神经元nNOS不仅可以激活脊髓小胶质细胞,还可以激活小胶质细胞内的p38,从而表明了神经元和小胶质细胞之间可能存在信息交流,p38MAPK可能在脊髓nNOS介导的吗啡吗啡镇痛耐受中起着重要的作用。

这是一种新见解。

第二章脊髓星型胶质细胞JNK在吗啡耐受中的作用 为了探讨脊髓JNK在吗啡耐受中的作用,本试验通过对SD大鼠连续7天鞘内注射吗啡15μg建立吗啡耐受的动物模型,免疫组织化学方法检测吗啡耐受过程中pJNK的表达情况。

结果表明,慢性鞘内注射吗啡的过程中,免疫组织化学染色显示脊髓背角pJNK的表达随着吗啡耐受程度的增加而逐步增加。

免疫荧光双染表明pJNK主要存在于脊髓星型胶质细胞。

提示在吗啡耐受过程中星型胶质细胞中的JNK被激活。

为研究pJNK在吗啡镇痛耐受中的作用,在每次吗啡注射前15分钟鞘内给予JNK特异性抑制剂SP600125(25μg),连续7天。

采用50℃热水甩尾法观察吗啡的镇痛效果。

结果表明,SP600125本身对痛阈无影响,但与吗啡合用可以明显抑制吗啡镇痛耐受的形成,提示脊髓星型胶质细胞JNK介导吗啡镇痛耐受的形成。

为观察SP600125能否拮抗早期形成的吗啡耐受,于吗啡耐受诱导后第4天开始给予SP60012525μg,15分钟后注射吗啡,连续注射4天。

实验结果表明,在耐受早期,SP600125仍可以抑制其进一步形成:

与吗啡耐受组相比,于注射吗啡第7天,在SP600125+吗啡组,吗啡仍可以产生明显的镇痛作用。

为了进一步观察SP600125是否可以逆转已经形成的吗啡耐受,我们于鞘内注射吗啡的第8天开始注射SP600125,连续注射4天,结果发现SP600125仍然能使吗啡恢复部分镇痛作用。

上述结果提示脊髓星型胶质细胞JNK的激活参与了吗啡耐受的发生和维持,在吗啡耐受的后期也发挥了重要的作用。

本文为深入阐明脊髓星型胶质细胞JNK在吗啡镇痛耐受中的作用提供了新颖的实验依据,也为防治吗啡耐受提供了新的作用靶点。

第三章脊髓星型胶质细胞JNK在MK801抗吗啡耐受中的作用 为了探讨吗啡耐受过程中脊髓星型胶质细胞JNK是否受NMDA受体调制,我们使用了NMDA受体拮抗剂MK801.在实验中,通过对SD大鼠连续7天鞘内注射吗啡15μg建立吗啡耐受的动物模型,用50℃热水甩尾法观察吗啡的镇痛效果。

结果显示,慢性鞘内注射吗啡7天后,吗啡镇痛作用明显下降,表明吗啡耐受的形成;鞘内注射NMDA受体非竞争性拮抗剂MK801(3.3μg)本身对痛阈无影响,但与吗啡合用具有显著的抗吗啡耐受作用。

从而证实了MK801能拮抗吗啡耐受NMDA受体介导吗啡镇痛耐受。

为了观察MK801对吗啡耐受过程中被激活的的脊髓星型胶质细胞及其pJNK的影响,免疫组织化学方法检测星型胶质细胞特异性标记物GFAP和pJNK表达情况。

结果表明,吗啡耐受组脊髓背角GFAP明显上调,而且星型胶质细胞胞体变大,突起变粗,提示慢性吗啡处理能激活脊髓星型胶质细胞;持续7天鞘内注射MK801可以显著抑制慢性应用吗啡所诱导的星型胶质细胞GFAP的上调,形态改变也较单纯吗啡组减轻。

同时,MK801+吗啡组脊髓星型胶质细胞pJNK阳性细胞数较单纯吗啡组明显下降。

提示NMDA受体拮抗剂MK801可以通过抑制脊髓星型胶质细胞及其JNK的激活而发挥其抗吗啡耐受作用。

本文为深入阐明MK801的抗吗啡镇痛耐受机制提供了新颖的实验资料,并提示在吗啡镇痛耐受中,胶质细胞及其JNK的激活是NMDA受体依赖的。

第四章胶质细胞在ATP代谢中的作用 本研究体外培养各种神经细胞,包括神经元、星型胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞,采用生物荧光ATP试剂盒(bioluminescent ATP assay kit)和Chrono—log照度计(Chrono—log luminometer)检测ATP的释放量,共聚焦显微镜观察100μM ATP刺激对各种细胞产生钙波的影响。

结果显示,相对于神经元和小胶质细胞,星型胶质细胞是最主要的ATP释放细胞;而且相同浓度ATP刺激下星型胶质细胞产生的钙波最强,小胶质细胞次之,神经元最少。

提示胶质细胞是释放ATP和产生钙波的主要细胞,其中星型胶质细胞的作用最大。

为了进一步研究释放出来的ATP在各种细胞的降解情况,500μM ATP和500μM AMP分别孵育各种细胞30分钟后,采用malachite green assay检测反应中产生的磷酸根(Pi)推测ATP\AMP降解总量,高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)检测孵育后的各种代谢成分。

结果表明,ATP孵育30分钟后,星型胶质细胞分解ATP的总量最多,小胶质细胞次之,神经元最少;分析各种代谢成分,提示星型胶质细胞分解ATP生成ADP的能力很强,小胶质细胞分解ADP生成AMP的能力很强。

AMP孵育30分钟后,少突胶质细胞分解AMP的总量最多,星型胶质细胞次之;分析各种代谢成分,提示少突胶质细胞生成腺苷的能力最强,星型胶质细胞生成肌苷的能力最强,另外星型胶质细胞还能生成IMP。

提示胶质细胞在ATP的降解过程中发挥了主要作用,其中因此,从某种程度上讲,ATP的代谢是各种嘌呤类分子在胶质细胞之间传递的过程。

我们若想利用某种分子,就可以以某种特定胶质细胞为切入点,增强生成该分子的细胞功能,或破坏分解该分子的细胞功能,使特定分子在特定情况下最大程度的发挥有利作用。

上述研究为进一步探讨胶质细胞及ATP与其代谢物在吗啡耐受或其他病理情况中的作用提供了新思路。

结论:

1.本文首次提出,nNOS特异性抑制剂7-NINA能显著地抑制脊髓小胶质细胞OX—42和p—p38的表达,提示nNOS可能是吗啡耐受过程中激活小胶质细胞及其p38MAPK途径的机制之一,从而表明了神经元和小胶质细胞之间可能存在信息交流; 2.慢性鞘内注射吗啡可激活脊髓背角星型胶质细胞JNK的表达;脊髓星型胶质细胞JNK参与了吗啡耐受的形成和维持; 3.首次证实,NMDA受体抑制剂MK801能显著地抑制吗啡耐受诱导的星型胶质细胞GFAP和pJNK的表达,提示NMDA受体可能是吗啡耐受过程中激活星型胶质细胞及pJNK途径的机制之一; 4.本文首先提出,正常情况下,胶质细胞是释放ATP和形成钙波的主要细胞,而且主要是星型胶质细胞的作用; 5.首次证实,胶质细胞是分解ATP的主要细胞,其中星型胶质细胞是分解ATP为ADP的主要细胞,小胶质细胞是分解ADP为AMP的主要细胞,少突胶质细胞是分解AMP为腺苷的主要细胞,星型胶质细胞是生成肌苷和IMP的主要细胞..……

全文目录


文摘
英文文摘
前 言
第一章 脊髓小胶质细胞p38MAPK在nNOS介导的吗啡耐受中的作用
1.1引言
1.2材料和方法
1.3实验结果
1.4讨论
1.5小结
1.6参考文献
第二章 脊髓星型胶质细胞JNK在吗啡耐受中的作用
2.1引言
2.2材料和方法
2.3结果
2.4讨论
2.5小结
2.6参考文献
第三章 脊髓星型胶质细胞JNK在MK801抗吗啡耐受中的作用
3.1引言
3.2材料和方法
3.3结果
3.4讨论
3.5小结
3.6参考文献
第四章 胶质细胞在ATP代谢中的作用
4.1引言
4.2材料和方法
4.3结果
4.4讨论
4.5小结
4.6参考文献
结论
附录

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