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绿色荧光蛋白融合表达法研究黄瓜α-半乳糖苷酶亚细胞定位

专 业: 蔬菜学
关键词: 黄瓜 体内同化物 α-半乳糖苷酶 亚细胞定位 生物学原理 绿色荧光蛋白融合表达法
分类号: S601  S642.2
形 态: 共 59 页 约 38,645 个字 约 1.849 M内容
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内容摘要


黄瓜(Cucumis sativus L.)以水苏糖作为体内同化物的主要运输形式,但其果实中却只含有蔗糖、葡萄糖和果糖等可溶性糖。

经韧皮部远距离运输而来的水苏糖到达库器官后,如何卸载并转化为蔗糖这一生理学过程一直不明。

在亚细胞水平研究水苏糖分解为蔗糖过程中的关键酶-α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)的空间表达模式可为阐明该问题提供重要线索。

为此,本实验构建了由CaMV35S启动子调控的、2种黄瓜α-半乳糖苷酶的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)融合表达载体。

运用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术,以质粒pCambia1303为模板扩增了CaMV35S启动子序列;以质粒pEGFP-N1为模板扩增了EGFP编码序列;运用反转录聚合酶链式反应(Reverse transcript-PCR,RT-PCR)技术,以黄瓜总RNA为模板扩增了黄瓜酸性α-半乳糖苷酶I或碱性α-半乳糖苷酶I编码序列。

将上述三个片段插入表达载体pCambia1381*c的多克隆位点,分别构建了EGFP位于目的基因C端的2个α-半乳糖苷酶基因-EGFP融合表达载体。

基因枪法将上述经测序验证的2个表达载体分别导入洋葱表皮和黄瓜愈伤组织细胞,共聚焦显微镜下观察EGFP的表达情况。

结果表明:

黄瓜酸性α-半乳糖苷酶I在包括液泡在内的整个细胞中均有表达,而黄瓜碱性α-半乳糖苷酶I在细胞核和细胞周边表达..……

全文目录


文摘
英文文摘
论文说明:缩略词表
引 言
第一章 文献综述——绿色荧光蛋白的研究进展
1 GFP的研究历史
2 GFP的结构和光谱特性
2.1 GFP的分子结构
2.2 GFP的发光机制
2.3 GFP的光谱特性
3 GFP作为报告基因的优点
3.1检测方便,荧光性质稳定
3.2易于构建载体
3.3可直接用于活体测定
3.4共用性和通用性
3.5不受假阳性干扰,灵敏度高
3.6可制成永久标本
3.7易于得到突变体
4影响GFP表达强度的因素
4.1表达温度对GFP荧光强度的影响
4.2酸碱度对GFP荧光强度的影响
4.3化学试剂对GFP荧光强度的影晌
4.4表达时间对GFP荧光强度的影响
5对GFP的遗传改进
5.1更换GFP生色团氨基酸
5.2改变碱基成分
5.3改变GFP基因序列
6绿色荧光蛋白在生物技术中的应用
6.1分子标记
6.2生物传感器
6.3药物筛选
6.4基因表达的定量分析
6.5新型免疫标记物
7存在的问题及展望
第二章 2种黄瓜α-半乳糖苷酶基因-EGFP融合表达载体的构建
1实验材料
1.1植物材料
1.2引物、试剂及载体
2实验方法
2.1质粒的提取
2.2 DH5a大肠杆菌感受态细胞的制备
2.3黄瓜α-半乳糖苷酶-EGFP融合表达载体的构建
3结果与分析
3.1重组质粒①的验证分析
3.2重组质粒②的验证分析
3.3重组质粒③的验证分析
第三章 黄瓜α-半乳糖苷酶基因的亚细胞定位分析
1实验材料
1.1植物材料
1.2主要试剂
2实验方法
2.1试剂盒法提质粒③
2.2植物材料的准备
2.3金粉制备
2.4微弹制备
2.5基因枪(BioRad PDS-1000/He)瞬时转化与观察
3结果与分析
讨论
参考文献

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中图分类: > S601 > 农业科学 > 园艺 > 一般性问题 > 生物学原理
其他分类: > S642.2 > 农业科学 > 园艺 > 瓜类

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