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嗜酸氧化亚铁硫杆菌启动子探针载体的构建及petⅡ启动子的分离鉴定

专 业: 生物工程
关键词: 嗜酸氧化亚铁硫杆菌 启动子探针载体 petⅡ启动子 启动子分离 启动子鉴定
分类号: Q81
形 态: 共 47 页 约 30,785 个字 约 1.473 M内容
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内容摘要


启动子是基因表达调控的重要顺式元件,也是基因工程表达载体的一个重要元件。

启动子的克隆对于构建基于工程载体,表达目的蛋白有着重要的意义。

本论文中,为了研究原核启动子结构与功能。

以pSV-β-galactosidase质粒为骨架,通过定点突变的方法引入一个新的BstBI单酶切位点,构建了能在大肠杆菌(Escherichia coli)中正常复制及表达的pSVB启动子探针载体。

嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)中由cycA2,sdrA2,petA282C2等基因组成的petⅡ操纵子编码一个电子传递bcl复合体,位于cycA2基因编码区上游序列具有启动子结构特征。

本文利用PCR的方法将A.ferrooxidans菌cycA2基因上游DNA片段克隆至pSVB启动子探针载体β-半乳糖苷酶基因上游,替代其原有的启动子(gpt启动子),得到重组质粒pAP2.将质粒导入大肠杆菌(Escherichia coli)进行表达,通过检测β-半乳糖苷酶活性,来鉴定启动子活性强弱。

酶活性分析表明,A. ferrooxidans菌cycA2基因上游DNA片段具有显著的启动子活性,同时也说明此启动子探针载体可以用于克隆并鉴定源自A.ferrooxidans菌的重要功能基因的潜在启动子区。

进一步对petⅡ启动子区序列分析发现,在其cycA2基因编码区上游-95bp~-90bp处(序列为“TTGATA”)和-59bp~-54bp(序列为“TATGCT”)处存在两个符合原核生物启动子核心元件特征的位点,即类似-35区和-10区的序列。

采用定点突变技术,在-95bp~-90bp处将其第一个碱基由“T”突变为“G”,结果导致启动子活性骤降至野生型的15%左右;而将-59bp~-54bp序列第一个碱基由“T”突变为“C”,则使启动子活性降至野生型的59%。

上述结果表明:

这两个区域是petⅡ启动子的关键位点,确定为启动子的-35区和-10区..……

全文目录


文摘
英文文摘
第一章 绪论
1.1 A.ferrooxidans菌铁硫代谢系统介绍
1.1.1 A.ferrooxidans菌硫氧化系统
1.1.2 A.ferrooxidans菌亚铁氧化系统
1.1.3 petⅡ操纵子
1.2启动子研究方法概述
1.2.1启动子的结构和特点
1.2.2启动子的识别方法
1.2.3启动子克隆的方法
1.2.4启动子研究的方法
1.3课题的研究目的与研究内容
1.3.1依据和目的
1.3.2论文的主要研究内容
1.3.3论文课题受资助情况
第二章 启动子探针载体的构建
2.1实验材料
2.1.1菌种和质粒
2.1.2培养基
2.1.3质粒抽提试剂
2.2实验方法
2.2.1感受态细胞制备
2.2.2质粒提取
2.2.3定点突变PCR
2.2.4 PCR扩增产物的鉴定
2.2.5酶切PCR产物及载体
2.2.6载体和目的片段连接反应
2.2.7转化
2.2.8目的载体的筛选与鉴定
2.3结果与讨论
2.3.1质粒突变及测序分析
2.3.2启动子探针载体pSVB功能分析
2.4本章小结
第三章 PETII启动子的克隆与活性分析
3.1实验材料
3.1.1菌种与质粒
3.1.2培养基
3.1.3酶活性分析试剂
3.2实验方法
3.2.1 A.ferroox.idans基因组DNA提取
3.2.2petⅡ非编码区扩增
3.2.3 PCR产物鉴定及双酶切
3.2.4探针载体和目的片段连接反应
3.2.5转化
3.2.6阳性克隆的筛选
3.2.7 β-半乳糖苷酶活性测定
3.3结果与讨论
3.3.1 petⅡ非编码区测序
3.3.2 β-半乳糖苷酶表达水平分析
3.4本章小结
第四章 PETII启动子核心区突变研究
4.1实验材料
4.1.1菌种与质粒
4.1.2培养基
4.1.3银染试剂
4.2实验方法
4.2.1 A区定点突变体构建
4.2.2 B区定点突变体构建
4.3结果与讨论
4.3.1petⅡ启动子分析与核心区突变
4.3.2突变对启动子活性的影响
4.4本章小结
第五章 结论
参考文献

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中图分类: > Q81 > 生物科学 > 生物工程学(生物技术)

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