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扁桃酸消旋酶和扁桃酸脱氢酶基因的克隆及表达

专 业: 生物化工
关键词: 扁桃酸消旋酶 扁桃酸脱氢酶 基因克隆 生物催化 铜绿假单胞菌
分类号: Q558.9  TQ033
形 态: 共 44 页 约 28,820 个字 约 1.379 M内容
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内容摘要


苯乙酮酸(PGA),又称苯甲酰甲酸(BFA),是应用广泛的有机合成中间体。

可以用来合成多种医药和农药。

通过与金属元素络合,又发现它可作为荧光材料的敏化剂和有机氧化反应的催化剂,更加引起人们的重视。

扁桃酸消旋酶(MR)和扁桃酸脱氢酶(MDH)是微生物体内代谢扁桃酸生成苯乙酮酸的两个关键酶。

根据研究结果,以扁桃酸为唯一碳源筛选得到具有高效转化扁桃酸活性的菌株,对其中活性较高的62号菌进行了菌种生理生化及16S rDNA的鉴定工作,证明是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。

实验表明62号菌能同时转化R-及S-扁桃酸,是一株可作为克隆扁桃酸消旋酶基因(mdlA)和扁桃酸脱氢酶基因(mdlB)的理想菌株。

以62号菌染色体DNA为模板,PCR扩增获得mdlA+mdlB基因全长;PCR产物经纯化后与T载体相连,构建克隆载体pT-mdlA+mdlB:

pT-mdlA+mdlB经NdeⅠ\NotⅠ双酶切后将目的基因插入pET30a(+)载体的多克隆位点(Mcs),构建了表达重组质粒pET30a-mdlA+mdlB;SDS-PAGE结果表明,重组菌在0.2mM IPTG的诱导下成功表达了43KDa的MDH及38KDa的MR。

利用重组菌全细胞转化扁桃酸生产苯乙酮酸的初步研究表明,在0.2mM IPTG(或0.5%乳糖)作诱导物,1.0%的底物浓度下,48h内重组菌能达到97.40%的转化率;并且采用游离细胞转化时,效率更高;转化效率受底物浓度的影响较大..……

全文目录


文摘
英文文摘
论文说明:符号与缩略语说明
1绪论
1.1生物催化技术研究概况
1.1.1生物催化技术
1.1.2生物催化在有机合成中的应用
1.1.3生物催化的主要方式
1.2苯乙酮酸研究概况
1.2.1苯乙酮酸的理化性质
1.2.2苯乙酮酸的用途
1.2.3苯乙酮酸的制备
1.3本课题的主要研究内容与研究意义
1.3.1主要研究内容
1.3.2研究意义
2扁桃酸代谢菌株的筛选及鉴定
2.1引言
2.2材料与试剂
2.2.1主要仪器
2.2.2主要试剂
2.2.3培养基配方
2.3实验方法
2.3.1菌株筛选方法
2.3.2高转化活力菌株的保藏
2.3.3菌株的生理生化实验
2.3.4菌株的16S rDNA鉴定
2.3.5分析方法
2.4结果与讨论
2.4.1筛选结果
2.4.2 62号菌株鉴定结果
2.4.3菌株对底物扁桃酸的利用
2.5本章小结
3扁桃酸消旋酶及扁桃酸脱氢酶基因的克隆与表达
3.1前言
3.2材料与试剂
3.2.1菌株和质粒
3.2.2实验仪器
3.2.3主要试剂
3.2.4培养基和常用溶液的配制
3.3实验方法
3.3.1扁桃酸消旋酶及扁桃酸脱氢酶基因的PCR扩增
3.3.2 PCR产物的TA克隆
3.3.3重组表达质粒的构建
3.3.4目的蛋白的表达检测
3.3.5重组菌全细胞转化扁桃酸生成苯乙酮酸
3.3.6分析方法
3.4结果与讨论
3.4.1目的基因的PCR扩增
3.4.2 mdlA+mdlB基因TA克隆鉴定
3.4.3表达重组质粒的构建
3.4.4表达产物的SDS-PAGE鉴定
3.4.5重组菌全细胞转化实验的研究
3.5本章小结
4结论与展望
4.1结论
4.2展望
参考文献

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中图分类: > Q558.9 > 生物科学 > 生物化学 > 酶 > 异构酶
其他分类: > TQ033 > 工业技术 > 化学工业 > 一般性问题 > 化学反应过程 > 生物化学过程

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