优秀研究生学位论文题录展示

重组E.coli生产类人胶原蛋白发酵调控策略与500L中试规模放大方法优化

专 业: 生物化工
关键词: 胶原蛋白 类人胶原蛋白 发酵过程 调控策略 生产工艺
分类号: Q512.6
形 态: 共 113 页 约 74,015 个字 约 3.54 M内容
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内容摘要


本研究旨在建立一套完整的重组Escherichia coli生产类人胶原蛋白(human—likecollagen,HLC)的中试规模生产工艺,并通过对各单元操作从实验室规模到中试规模的放大研究,为进一步将该工艺放大到工业生产奠定基础。

重组E.coli的高密度培养是HLC生产过程的核心单元,其放大的成功与否直接关系到整个工艺过程。

为了明确影响发酵过程的关键因素,从而选择合适的放大准则和方法,本文对发酵过程中二氧化碳和乙酸的影响进行了系统研究。

有大量文献表明,二氧化碳对重组E. coli发酵有负面影响。

然而,关于二氧化碳对重组E.coli,特别是重组蛋白表达方面的定量研究却未见报道。

本研究采用二氧化碳脉冲法首次考察了重组E. coli生长不同阶段二氧化碳浓度对重组蛋白生产的影响。

研究结果表明,当在分批培养阶段施加浓度为20%(v\v)二氧化碳脉冲时,细胞生长明显受到抑制;而在补料阶段引入该脉冲时,却引起了比生长速率的小幅上升;二氧化碳对HLC表达的抑制只发生在HLC的表达阶段,即在蛋白表达诱导阶段引入浓度为20%(v\v)二氧化碳脉冲3小时,则最终HLC浓度下降33.9%。

尽管二氧化碳脉冲的浓度越高,作用时间越长,其相应的抑制或促进作用也越明显,但当二氧化碳脉冲浓度小于等于10%时,对发酵过程却几乎没有影响。

针对重组E. coli发酵过程的关键问题—乙酸抑制作了系统研究。

研究结果表明,在分批培养阶段乙酸对E. coli细胞有明显的抑制作用,但在补料培养阶段,其影响却并不明显;而乙酸对HLC表达的抑制只发生在HLC的表达阶段。

本文首次建立了这一评价重组E.coli细胞生长不同阶段乙酸影响的方法。

而建立该法的理论依据就是在葡萄糖饥饿阶段,重组E. coli细胞可以利用乙酸。

为此,本研究也首次讨论了在细胞生长不同阶段,利用葡萄糖饥饿以诱导乙酸吸收对发酵过程的影响。

在发酵放大过程中,合适的种子扩大培养过程的建立对于成功的放大也至关重要。

为了建立最优的种子扩大培养过程,本研究考察了三级种子不同移种阶段和不同种子培养基浓度对发酵过程的影响。

结果表明:

在对数期后期移种,HLC产率最高;另外,当种子培养基葡萄糖浓度为20g\L时,其后发酵过程所需的培养时间较短,HLC表达量较高,HLC平均产率最高,达到0.518g\L\h。

由乙酸的相关研究可知,乙酸对本表达体系具有较强的抑制作用,因而本研究建立了以控制乙酸产生为根本目的的溶氧探测补料技术,该技术具有很强的适应性,可在不同的环境中迅速得到发酵过程的最佳补料方案。

采用溶氧探测补料技术,在实验室规模获得的最终细胞干重和HLC浓度分别为69.1 g\L和13.1 g\L,该值与以前根据比生长速率优化的结果基本一致。

而放大到中试规模时,尽管乙酸浓度和实验室规模基本相同,优化诱导时机后获得的HLC表达水平也基本相同,但最终细胞干重和HLC浓度有一定程度下降,分别为51.7g\L和9.6g\L。

直接放大后HLC产量下降的原因之一可能是不同规模发酵罐氧传递能力不同所致。

针对该问题,通过测定不同规模发酵罐的体积氧传递系数,并建立了体积氧传递系数对操作参数(通气量、搅拌速度和装液量)的关联方程,使得不同规模的发酵罐在氧的传递方面具有可比性。

实验室小规模发酵罐kLa值对操作参数的经验关联式为:

(kLa)L=0.0111Q0.3185N1.5131VL-0.4803.中试规模发酵罐kLa值对操作参数的经验关联式为:

(kLa)P=0.2690Q0.2983N1.2727VL-0.404。

根据体积氧传递系数的关联方程,分别以kLa和p*kLa为放大基准进行放大。

由于本发酵体系对二氧化碳较不敏感,中试规模(500L)中加压操作得到了成功应用。

即以p*kLa为放大基准进行放大规模的不诱导的分批.补料培养,最终获得的细胞干重为77.9g\L,略低于实验室规模培养获得的细胞干重(80.3g\L),也低于以kLa为放大基准获得的中试规模培养的最终细胞干重(90.0g\L)。

但以p*kLa为基准放大,初始装液量(285L)远高于以kLa为基准放大时的初始装液量(105L);诱导培养后,最终细胞干重达到68.4g\L,最终HLC浓度为13.0g\L,基本同实验室规模。

文中还建立了HLC中试纯化工艺,并对其中影响蛋白收率和蛋白纯度的主要工艺单元:

高压匀浆、沉淀、超滤及离子交换层析进行了放大研究。

结果表明,高压匀浆不用改变任何操作参数可直接放大;超滤过程仅改变和膜面积相关参数也可得到满意的放大结果;对于沉淀单元,由于搅拌釜装置变化,在中试规模重新优化了沉淀时间:

即沉淀70min后纯化效果最好;保持线速度恒定进行层析单元的放大也获得了较好结果。

中试规模纯化工艺得到HLC的纯度为95.4%,收率为65.4%,与实验室规模纯化结果相比(HLC纯度与收率分别为96.4%,71.7%)仅略有下降..……

全文目录


文摘
英文文摘
第一章 文献综述
1.1生物产品生产过程放大
1.2重组E.coli高密度发酵
1.2.1乙酸对重组E.coli高密度发酵的影响
1.2.2重组E.coli高密度发酵过程乙酸的控制
1.3重组E.coli高密度发酵的放大
1.3.1放大原理
1.3.2物理放大参数与方法
1.3.3其他放大方法
1.3.4过程放大需考虑的其他因素
1.3.5重组大肠杆菌发酵过程放大相关难题
1.4生物技术产物纯化工艺及放大
1.4.1生物技术产物分离提纯的特点
1.4.2生物技术产物分离提纯工艺
1.4.3生物技术下游过程设计的优化
1.5本研究的目的、意义及内容
1.5.1目的与意义
1.5.2实验内容及拟解决的问题
本章符号含义
第二章 二氧化碳的生成及其对HLC生产的影响
2.1实验材料与方法
2.1.1供试菌种
2.1.2培养基
2.1.3主要仪器和设备
2.1.4实验方法
2.1.5分析方法
2.2结果与讨论
2.2.1重组E.coli高密度发酵过程的特征和CO2的释放
2.2.2不同细胞生长阶段CO2对发酵过程的影响
2.2.3 CO2浓度和脉冲持续时间对发酵过程的影响
2.3本章小结
第三章 乙酸的生成及再利用
3.1重组E.coli高密度发酵过程中乙酸的代谢途径
3.2实验材料与方法
3.2.1供试菌种
3.2.2培养基
3.2.3主要仪器和设备
3.2.4实验方法
3.2.5分析方法
3.3结果与讨论
3.3.1重组E.coli高密度发酵过程乙酸积累的特点
3.3.2葡萄糖饥饿阶段乙酸的再利用
3.3.3乙酸浓度的影响
3.4本章小结
第四章 种子扩大培养对发酵过程的影响
4.1实验材料与方法
4.1.1供试菌种
4.1.2培养基
4.1.3主要仪器和设备
4.1.4实验方法
4.1.5分析方法
4.2结果与讨论
4.2.1种子培养过程特点
4.2.2移种阶段的影响
4.2.3种子培养基浓度的影响
4.3本章小结
第五章 反馈补料发酵过程的建立
5.1理论基础
5.2实验材料与方法
5.2.1供试菌种
5.2.2培养基
5.2.3主要仪器和设备
5.2.4实验方法
5.2.5分析方法
5.3实验结果
5.3.1实验室规模培养
5.3.2中试规模的非诱导培养
5.3.3中试规模下诱导时机的优化
5.3讨论
5.4本章小结
第六章 发酵罐的体积氧传递系数的冷模测定
6.1体积氧传递系数kLa测定原理及方法
6.1.1亚硫酸盐法测定体积氧传递系数kLa原理
6.1.2实验方法
6.2体积氧传递系数kLa相关关联式
6.3实验结果与讨论
6.3.1搅拌转速对体积氧传递系数kLa的影响
6.3.2通气流量对体积氧传递系数kLa的影响
6.3.3关联方程
6.3本章小结
本章符号含义
第七章 基于氧传递的放大
7.1实验材料与方法
7.1.1供试菌种
7.1.2培养基
7.1.3主要仪器和设备
7.1.4实验方法
7.1.5分析方法
7.2实验结果与讨论
7.2.1 kLa相同法
7.2.2 p*kLa相同法
7.2.3两种放大方法的分析与比较
7.3本章小结
本章符号含义
第八章 HLC分离纯化的中试工艺放大
8.1 HLC纯化工艺路线
8.2单元操作放大
8.2.1细胞破碎
8.2.2沉淀
8.2.3超滤
8.2.4离子交换层析
8.3中试规模纯化结果
结论
参考文献

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中图分类: > Q512.6 > 生物科学 > 生物化学 > 蛋白质 > 单纯蛋白

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