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茶叶抗坏血酸过氧化物酶(APX)的生理学与分子生物学研究

专 业: 茶学
关键词: 茶叶 抗坏血酸过氧化物酶 维生素C 同工酶 基因克隆 定量表达
分类号: TS971
形 态: 共 135 页 约 88,425 个字 约 4.23 M内容
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内容摘要


抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)是植物活性氧代谢中重要的抗氧化酶之一,又是维生素C代谢的主要酶类。

茶叶中富含维生素C,作为茶叶中重要活性营养成分,维生素C在茶叶加工和储存过程中易造成大量损失。

开展茶叶中维生素C代谢相关基因的研究,将有助于了解茶叶中维生素C代谢的机制,为调控茶叶维生素C水平提供理论依据。

本研究以茶叶(Camellia sinensis)为供试材料,研究了茶叶抗坏血酸过氧化物酶的生理特性及分子机理。

通过对茶叶APX活性测定条件的探讨和建立,研究茶树不同品种、茶叶新梢不同生育时期、茶叶加工过程APX活性、同工酶的动态变化以及及维生素C含量的变化特点,探讨茶叶APX的代谢生理和作用机制;克隆了茶叶cAPX基因,并利用生物信息学方法对它的结构和功能进行预测和分析;在此基础上应用荧光定量PCR技术分析了茶叶cAPX基因的定量表达。

研究结果如下:

1.茶叶抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的测定方法建立 探讨了茶树鲜叶抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的测定条件。

结果表明,茶叶APX测定的最佳条件为,聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)加入量约为鲜叶重的1.5倍,酶提取液pH为7.8,反应液pH为7.0,抗坏血酸(AsA)浓度为0.50 mmol\L时茶树鲜叶APX活性最高。

试验样品APX活性随冷冻贮藏天数增加,不断降低,样品应可能保持芽叶的新鲜度。

2.不同茶树品种、新梢不同生育时期APX酶活性研究 选择福建代表性的绿茶品种(福鼎大白茶、福云6号)和乌龙茶品种(铁观音、毛蟹、黄旦、本山、肉桂),分析了不同茶树品种以及茶树鲜叶不同叶位APX活性的变化。

结果表明,福建主要7个茶树品种以福云6号的APX活性最高,铁观音的APX活性最低,绿茶品种的APX活性高于乌龙茶品种,不同品种APX活性大小依次为福云6号>福鼎大白茶>肉桂>毛蟹>黄旦>本山>铁观音;茶树鲜叶不同叶位APX活性变化趋势为:

芽>第一叶>第二叶>第三叶>老叶>嫩茎,随着鲜叶成熟度增加,APX活性下降。

3.茶叶加工过程中APX活性及维生素C动态变化研究 探讨茶叶不同萎凋程度及乌龙荼加工过程APX和维生素C的动态变化。

结果表明,茶叶萎凋过程中APX活性呈“下降-上升-下降”趋势,相对活性由100%降至1.7%,萎凋不同阶段APX活性差异显著;萎凋过程中茶叶维生素C含量呈缓慢减少趋势,维生素C保留在鲜叶的80%以上,只经过萎凋的茶类(传统白茶)维生素C保留较为丰富。

乌龙茶加工过程APX活性也呈“下降-上升-下降”趋势,相对活性由100%降至17.45%,炒青前各工序茶叶的APX活性差异显著,炒青后各工序茶叶的APX活性差异不显著;维生素C含量呈减少趋势,相对保留量由100%降至9.01%,揉捻工序维生素C含量下降幅度最大,其次是摇青工序。

4.不同茶树品种及茶叶加工过程中APX同工酶的研究 运用同工酶技术分析福建代表性绿茶、乌龙茶品种APX同工酶差异,分析探讨茶叶不同萎凋程度APX同工酶动态变化。

结果表明,不同茶树品种APX同工酶存在差异,茶叶APX同工酶共有6条谱带,其中A2、A4、A5和A6四条为不同品种茶树所共有,A4、A5谱带为茶叶APX的重要同工酶。

7个不同茶树品种的酶带,福鼎大白茶与毛蟹的酶带最亮最强,铁观音、黄旦与福云6号酶带最弱,除福云6号外,其他品种同工酶的表达量与APX活性存在相关性。

茶叶萎凋茶叶APX同工酶谱带数量减少,起主要作用的为A4、A5同工酶也逐渐减弱,但萎凋18 h同工酶谱带强度与数量增加。

同工酶的变化与APX酶活性具有相关性。

5.茶叶APX的cDNA克隆 从茶叶中克隆出了一个长度为1083 bP的cAPX-因的cDNA序列,经测序分析,其包含750 bP的开放读码框,编码250个氨基酸。

该基因在3′RACE与保守区重叠碱基数为321 bp,与5′RACE重叠碱基数是77 bp,非编码区5′有94 bp,3′有136 bp。

已将该基因序列登录Genbank,登录号为EU547804。

6.茶叶APX基因的生物信息学分析 利用生物信息学的方法对克隆的茶树cAPX基因的核酸序列及对应氨基酸序列的理化性质、结构特征、功能及系统演化关系等进行预测分析。

结果表明,茶叶cAPX是一分子量27.53 kDa,等电点pI5.59,比较稳定的酸性蛋白,属于亲水性蛋白,不含有跨膜信号,不具有信号肽;茶叶cAPX磷酸化位点有10个,丝氨酸(Ser)、酪氨酸(Tyr)磷酸化位点的各4个,苏氨酸(Thr)磷酸化位点2个,蛋白氨基酸序列9-31区域最有可能形成卷曲螺旋结构,α螺旋和不规则卷曲是茶叶cAPX蛋白最大量的结构元件。

茶叶cAPX基因参与的生物过程主要是响应化学刺激和应激反应,具有四吡咯结合、过氧化物酶活性和氧化活性分子功能。

蛋白的功能预测进一步证实茶叶cAPX属植物抗坏血酸过氧化物酶(Plant ascorbate-peroxidase)的蛋白质家族成员。

7.茶叶主要品种及茶叶加工中APX基因的定量表达 应用荧光定量PCR的方法对不同茶树品种APX基因的表达以及萎凋工艺过程中APX基因的表达进行定量分析。

结果表明,茶树不同品种APX基因表达量存在显著差异,相对表达量变化范围为0.65-5.69,6个茶树品种APX基因相对表达量的大小为毛蟹>福云6号>肉桂>福鼎大白茶>黄旦>铁观音。

茶叶萎凋过程中APX基因的表达量呈现“升高-降低-再升高-再降低”的趋势,相对表达量变化范围为0.02-7.46,茶叶APX基因的表达明显受到萎凋工艺处理的影响..……

全文目录


文摘
英文文摘
第一章 前言
1植物APX的研究进展
1.1 APX的分布与定位
1.2 APX的作用机制和生理功能
1.3 APX的分子生物学
1.4环境因子对APX的影响
2茶叶中主要酶研究进展
2.1茶叶加工中主要酶类变化研究
2.2茶叶同工酶的研究
2.3茶叶重要功能基因的克隆
3本研究的目的意义和研究内容
3.1研究的目的意义
3.2主要研究内容
第二章 茶树鲜叶APX活性测定方法的建立与变化规律探讨
1材料与方法
1.1材料和仪器
1.2试验方法
1.3试验处理
2结果与分析
2.1茶树鲜叶APX活性测定方法的建立
2.2茶树鲜叶APX活性的变化规律
3讨论
3.1茶树鲜叶APX活性的测定条件
3.2不同茶树品种APX活性变化
3.3茶树鲜叶不同叶位APX活性变化
第三章 茶叶加工过程APX活性及维生素C的变化
1材料与方法
1.1材料
1.2试验方法
2结果与分析
2.1茶叶萎凋过程APX活性变化
2.2乌龙茶加工过程中APX活性的变化
2.3茶叶萎凋过程维生素C变化
2.4乌龙茶加工过程中维生素C的变化
3讨论
3.1茶叶加工过程APX活性的变化
3.2茶叶加工过程维生素C含量的变化
3.3茶叶加工过程APX活性与维生素C含量的关系
第四章 茶叶APX同工酶分析
1材料与方法
1.1试验材料
1.2方法
2结果与分析
2.1不同茶树品种APX同工酶的差异分析
2.2茶叶萎凋过程中APX同工酶的变化
3讨论
3.1 AsA对茶叶APX同工酶电泳缓冲体系的作用
3.2不同茶树品种APX同工酶差异
3.3茶叶萎凋过程中APX同工酶的变化
第五章 茶叶APX基因克隆与生物信息学分析
1材料与方法
1.1材料
1.2主要仪器设备
1.3主要试剂
1.4方法
2结果与分析
2.1茶树鲜叶总RNA提取纯度与浓度检测
2.2 cAPX cDNA保守区的克隆
2.3茶叶cAPX cDNA的3RACE克隆结果
2.4茶叶cAPX cDNA的5RACE克隆结果
2.5茶叶cAPX基因全长序列拼接
2.6茶叶cAPX基因序列分析
2.7茶叶cAPX生物信息学分析
2.8与印度APX cDNA的序列分析比较
3讨论
3.1高纯度茶叶RNA提取
3.2茶叶cAPX基因克隆及序列分析
3.3茶叶cAPX基因生物信息学分析
3.4茶叶胞质型APX基因cDNA全长获得的意义
第六章 茶叶APX基因的定量表达
1材料与方法
1.1材料处理
1.2试剂与仪器
1.3总RNA提取以及纯度、完整性鉴定
1.4 cDNA合成
1.5实时荧光定量PCR
2结果与分析
2.1 RNA纯度和完整性
2.2标准曲线的建立
2.3目的基因和参照基因的特异性扩增
2.4不同茶树品种APX基因的表达量差异
2.5不同萎凋时间对福鼎大白茶APX基因的表达量的影响
3讨论
3.1实时荧光定量PCR技术在APX基因定量表达上应用
3.2不同茶树品种APX基因定量表达的差异
3.3茶叶萎凋过程APX基因定量表达的差异
第七章 结论
1本研究的主要结论
2本研究的主要创新点
参考文献
附录

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中图分类: > TS971 > 工业技术 > 轻工业、手工业 > 生活服务技术 > 美食学

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