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微生物酯酶的分离纯化及其酶学特性的研究

专 业: 生物化工
关键词: 微生物酯酶 分离纯化 酶学特性 硫酸铵沉淀
分类号: Q556  Q814.1
形 态: 共 70 页 约 45,850 个字 约 2.193 M内容
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内容摘要


本实验室筛选得到的微生物酯酶为胞内酶。

发酵得到的菌丝体经超声波破碎、高速冷冻离心后获得粗酶液。

粗酶液经硫酸铵分级沉淀、HiTrap Q Sepharose阴离子交换层析和Superdex G—75凝胶过滤最终获得了一定纯度的具有pNPA酯酶活性的三个水解酶:

酯酶Ⅰ、酯酶Ⅱ和酯酶Ⅲ。

对应的最终纯化倍数分别为36、21.6和39.4倍。

经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检验后发现,酯酶Ⅰ的纯度较高,在分子量约50kDa处有一较明晰的条带;酯酶Ⅱ和酯酶Ⅲ中杂蛋白含量较多,还需进一步纯化。

对硫酸铵沉淀后酶的酶学性质研究发现:

1.该酶的最适温度为50℃,45℃下热稳定性良好;20—50℃温度范围内酶催化反应的活化能Eα为22.2KJ\mol。

2.该酶的最适pH值为8.0,在pH为8.0—9.0范围内比较稳定。

3.金属鳌合剂EDTA显著的提高了酶的活性;而Cu2+、Fe2+、Zn2+、Al3+和Ag+显著地抑制了酶的活性。

4.该水解酶的动力学参数Km和Vm分别为3.13mmol\L和0.18μmol·min—1·mg—1. 5.该酯酶的催化活性受碳链长度的影响,对短碳链酯(<C8)具有较高的催化活性。

6.该酶的活性在不同的有机溶剂中随logP的增大而增大,在甲苯(logP=2.5)中,酶的活力达到最大。

继续增大溶剂的疏水性,在正庚烷(logP=4.0)中酶的活力反而降低。

该酶用于拆分生物素中间体内酯,当反应体系为水-甲苯两相体系,体系水相:

有机相(v\v)为2:10,水相pH值为7.0,反应温度为40℃,反应时间为48h时,水解率为24.5%,e.e.值达到91%。

在对底物与产物的分离提取研究时发现,底物内酯和产物酸分别溶于甲苯和水,通过萃取分离就可以将二者分离,经过重结晶即可得到较纯的内酯和酸的样品..……

全文目录


文摘
英文文摘
第一章 文献综述
1.1 引言
1.2 酯酶与脂肪酶的研究比较
1.3 分类
1.4 酯酶的应用
1.4.1 手性药物的合成
1.4.2 催化含D-氨基酸残基多肽的合成和水解
1.4.3 在食品上的应用
1.4.4 在环境保护中的应用
1.4.5 其它应用
1.5 酯酶的非水相催化
1.5.1 酯酶在有机相中的催化
1.5.2 酯酶在离子液体中的催化
1.5.3 酯酶在超临界流体中的催化
1.6 酯酶的基因改造
1.6.1 改变底物特异性和光学选择性
1.6.2 提高酶活性和稳定性
参考文献
第二章 微生物酯酶的分离与纯化
2.1 引言
2.2 实验材料
2.2.1 菌种
2.2.2 试剂及材料
2.2.3 常用溶液
2.2.4 主要仪器
2.3 实验方法
2.3.1 菌体的制备
2.3.2 酯酶酶活力的测定
2.3.3 Bradford考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度
2.3.4 粗酶液的制备
2.3.5 酯酶的纯化
2.3.6 SDS聚丙烯酞胺凝胶电泳
2.4 实验结果与讨论
2.4.1 细胞破碎方法的选择
2.4.2 硫酸铵分级沉淀
2.4.3 柱层析
2.4.4 SDS聚丙烯酞胺凝胶电泳
2.5 本章小结
参考文献
第三章 微生物酯酶酶学性质的研究
3.1 引言
3.2 实验材料
3.2.1 主要试剂
3.2.2 常用溶液
3.2.3 主要仪器及材料
3.3 实验方法
3.3.1 酶液及酶粉的制备
3.3.2 水相中酯酶酶学性质的研究
3.3.3 有机相中酯酶酶学性质的研究
3.4 结果与讨论
3.4.1 水相中酯酶酶学性质的研究
3.4.2 有机相中酯酶酶学性质的研究
3.5 本章小结
参考文献
第四章 微生物酯酶水解生物素中间体内酯的应用研究
4.1 引言
4.2 实验材料
4.2.1 菌种
4.2.2 主要试剂
4.2.3 常用溶液
4.2.4 主要仪器
4.3 实验方法
4.3.1 菌体的制备
4.3.2 分析方法
4.3.3 酯酶催化条件的研究
4.3.4 底物和产物的分离提取和鉴定
4.4 结果与讨论
4.4.1 酯酶催化条件的研究
4.4.2 底物和产物的分离提取和鉴定
4.5 本章小结
参考文献
结论与建议

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中图分类: > Q556 > 生物科学 > 生物化学 > 酶 > 水解酶
其他分类: > Q814.1 > 生物科学 > 生物工程学(生物技术) > 酶工程

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