优秀研究生学位论文题录展示

糖基化与非糖基化Onconase在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达、纯化与活性鉴定

专 业: 微生物学
关键词: Onconase 巴斯德毕赤酵母 分泌信号 糖基化 细胞毒性
分类号: Q939.124
形 态: 共 88 页 约 57,640 个字 约 2.757 M内容
阅 读: 全文阅读说明

内容摘要


Onconase,也称作P-30蛋白,是一种提取自北极豹蛙胚胎的强碱性核糖核酸酶。

它由104个氨基酸组成,氨基酸序列与三维结构分析显示它属于牛胰腺核糖核酸酶A超家族。

但Onconase与RNase A也存在不同之处:(1)Onconase含有牛胰腺核糖核酸酶A超家族特有的Cys87-cys104二硫键,该二硫键使其C端残基折向中央的β折叠片而形成了onconase特有的结构(2)Onconase的N端含有焦谷氨酸残基。

该非编码的残基是由当Onconase N端的谷氨酰胺暴露时自动环化形成的。

该环化结构为Onconase生物活性所必须的结构。

Onconase对肿瘤细胞具有细胞毒性和细胞抑制性,能够较好地抑制裸鼠体内移植肿瘤细胞的生长。

尽管其细胞毒性的机理仍未完全搞清楚,但Onconae的阳离子性和核糖核酸酶抑制剂的不亲合性是其具有细胞毒性的重要原因。

阳离子性能够使Onconase与肿瘤细胞的表面阴离子结合,核糖核酸酶抑制剂的不亲合性能够使通过胞吞作用进入细胞质内的Onconase降解靶RNA(主要是tRNA)。

抑制蛋白质生物合成最终导致肿瘤细胞凋亡。

最近有文献报道,非编码RNA也与Oncon..……

全文目录


摘要
第一章 前言
1.1 ONCONASE 的研究概述
1.1.1 Onconase 的结构和稳定性
1.1.2 Onconase 的抗肿瘤作用机制
1.1.3 Onconase 免疫调节和抗病毒作用
1.1.4 Onconase 存在的问题
1.2 巴斯德毕赤酵母表达系统概况
1.2.1 巴斯德毕赤酵母中常用的分泌信号
1.2.2 不同分泌信号引导的Onconase 在巴斯德毕赤酵母中的表达
第二章 实验材料
2.1 材料
2.1.1 菌株
2.1.2 质粒
2.1.3 细胞及实验动物
2.1.4 限制性内切酶及工具酶
2.1.5 试剂盒
2.1.6 核酸及蛋白分子量标准
2.1.7 引物
2.1.8 主要仪器和层析柱
2.2 试剂
2.2.1 主要试剂
2.2.2 主要培养基
2.2.3 主要溶液
第三章 实验步骤
3.1 目的基因的克隆
3.1.1 gONC 和agONC 基因的克隆
3.1.1.1 gONC 基因的克隆
3.1.1.2 agONC 基因的克隆
3.1.2 EAEA-gONC 和EAEA-agONC 融合基因的克隆
3.1.2.1 EAEA-gONC 融合基因的克隆
3.1.2.2 EAEA-agONC 融合基因的克隆
3.1.3 pre-gONC 和pre-agONC 融合基因的克隆
3.1.3.1 pre-gONC 融合基因的克隆
3.1.3.2 pre-agONC 融合基因的克隆
3.2 含不同分泌信号的表达载体的构建
3.2.1 表达载体pPIC9-gONC 和pPIC9-agONC 的构建
3.2.1.1 表达载体pPIC9-gONC 的构建
3.2.1.2 表达载体pPIC9-agONC 的构建
3.2.2 表达载体pPIC9-EAEA-gONC 和pPIC9-EAEA-agONC 的构建
3.2.2.1 表达载体pPIC9-EAEA-gONC 的构建
3.2.2.2 表达载体pPIC9-EAEA-agONC 的构建
3.2.3 表达载体pPIC9-pre-gONC 和pPIC9-pre-agONC 的构建
3.2.3.1 表达载体pPIC9-pre-gONC 的构建
3.2.3.2 表达载体pPIC9-pre-agONC 的构建
3.3 表达载体转化酵母表达菌株及目的基因的诱导表达
3.3.1 各表达载体的线性化
3.3.2 巴斯德毕赤酵母GS115 感受态细胞的制备
3.3.3 电转化
3.3.4 不同巴斯德毕赤酵母重组菌在摇瓶里的诱导表达
3.4 高效表达工程菌株的发酵罐培养及纯化
3.5 表达产物的鉴定和体外活性检测
3.5.1 表达产物的质谱检测和N 末端氨基酸残基分析
3.5.2 双倒数法测定表达产物的酶学参数
3.5.3 MTT 法检测表达产物的体外活性
第四章 实验结果
4.1 目的基因的克隆
4.1.1 gONC 和agONC 基因的克隆
4.1.2 EAEA-gONC 和EAEA-agONC 基因的克隆
4.1.3 pre-gONC 和pre-agONC 基因的克隆
4.2 含不同分泌信号表达载体的构建
4.2.1 pPIC9-gONC 和pPIC9-agONC 表达载体的构建与序列分析
4.2.2 pPIC9-EAEA-gONC和pPIC9-EAEA-agONC表达载体的构建与序列分析
4.2.3 pPIC9-pre-gONC 和pPIC9-pre-agONC 表达载体的构建与序列分析
4.3 不同分泌信号的表达载体转化表达菌株及高表达工程菌的筛选
4.4 工程菌5L 生物反应器培养
4.5 目的蛋白的纯化
4.5.1 目的蛋白的纯化的纯化过程
4.5.2 目的蛋白的质谱分析和N 端氨基酸测序
4.6 目的蛋白活性的体外评价
4.6.1 目的蛋白酶学性质的检测分析
4.6.2 MTT 法检测目的蛋白对肿瘤细胞的抑制作用
第五章 讨论
结论
参考文献

相似论文

  1. 1.报告基因法筛选克拉维酸高产菌 2.报告基因法比较两种放线菌启动子的活性,72页,Q939.124
  2. 分离自竹林内真菌的多样性分析及抗菌性筛选,72页,Q939.124
  3. 高产谷胱甘肽(GSH)酵母菌种的选育及发酵条件研究,55页,Q939.124
  4. 兼性厌氧产氢菌的静态优化培养及连续发酵产氢研究,60页,Q939.124
  5. 基于DGGE技术的混合糖发酵产氢菌的分离及特性研究,66页,Q939.124
  6. 乳链菌肽产生菌Lactococcus lacits subsp. Lactis的发酵工艺研究,72页,Q939.124
  7. 针叶树生斑痣盘菌分子系统学研究,65页,Q939.124
  8. SLY蛋白与2型猪链球菌感染,71页,Q939.124
  9. 异甜菊醇的微生物转化及生物活性的研究,86页,Q939.124
  10. 苜蓿、三叶草根瘤菌生物多样性和系统发育地位的研究,73页,Q939.114 S542.401
  11. hwtx-Ⅰ基因四价体表达载体构建及苏云金芽孢杆菌工程菌株研究,91页,Q939.124 S476.1 Q782
  12. 人CYP1A2与CYP2E1野生型酵母表达系统的建立和CYP1A2荧光药物筛选平台的建立,63页,Q939.124
  13. 短小芽胞杆菌脂肪酶YZ02的定向进化研究,66页,Q939.124
  14. 不同类型抗菌肽的协同抗菌作用研究,45页,Q939.92 S432.23
  15. 植物根瘤内Frankia生物多样性的研究,117页,Q939.114
  16. 四株放线菌的分类鉴定及代谢产物研究,145页,Q939.132
  17. 慢生型大豆根瘤菌GX201与固氮相关的putA、lrp基因的研究,121页,Q939.114
  18. 低品位含钾矿物微生物转化过程与机理研究,73页,Q939.97
  19. 放线菌YIM31634、YIM31333和YIM31182次生代谢产物的初步研究,102页,Q939.13
  20. 应用免培养法研究云南腾冲热海几个高温热泉的细菌多样性,67页,Q939.1
中图分类: > Q939.124 > 生物科学 > 微生物学 > 微生物分类学(系统微生物学)

© 2012 book.hzu.edu.cn