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1.报告基因法筛选克拉维酸高产菌 2.报告基因法比较两种放线菌启动子的活性

专 业: 微生物学
关键词: 克拉维酸 报告基因 诱变筛选 强启动子 链霉菌
分类号: Q939.124
形 态: 共 72 页 约 47,160 个字 约 2.256 M内容
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内容摘要


第一部分:报告基因法筛选克拉维酸高产菌

克拉维酸(clavulanic acid,CA),又名棒酸,是由棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)产生的一种次级代谢产物,其分子为一个稠合双环β-内酰胺结构,由β-内酰胺环(C3结构)和唑烷环(C5结构)构成。

它特有的3R,5R立体结构使其具有抑制β-内酰胺酶的活性,可与β-内酰胺酶的丝氨酸活性位点不可逆结合,使β-内酰胺酶失活,从而保护β-内酰胺类抗生素的活性。

其本身的抑菌作用非常微弱,临床上主要与β-内酰胺类药物联合应用。

本研究用报告基因的方法,对NTG诱变的含报告基因的工程菌进行筛选得到克拉维酸高产的突变菌株。

报告基因载体将克拉维酸生物合成调节基因ccaR的启动子,置于报告基因的前面构建出重组报告载体。

本研究使用了自主构建的双报告基因,即串联表达的卡那霉素抗性基因(neo)和邻苯二酚2,3-双加氧酶基因(xylE),降低了单报告基因筛选的一些缺陷。

将重组载体转入野生菌株中,再对菌株进行NTG诱变。

由于载体上的启动子与基因组中的相关基因的启动子是一样的,所以报告基因的表达变化反映了基因组中的相关基因的表达变化。

我们对报..……

全文目录


摘要(第一部分)
摘要(第二部分)
第一部分 : 报告基因法筛选克拉维酸高产菌
1 前言
1.1 β-内酰胺酶抑制剂-克拉维酸
1.1.1 克拉维酸产生菌
1.1.2 克拉维酸的作用机理
1.1.3 克拉维酸的生物合成
1.1.3.1 克拉维酸生物合成前体
1.1.3.2 克拉维酸生物合成途径
1.1.4 克拉维酸合成的基因调控
1.2 报告基因方法
1.2.1 邻苯二酚双加氧酶
1.2.2 邻苯二酚2,3-双加氧酶
1.2.3 邻苯二酚2,3-双加氧酶显色系统
1.3 Nitrocefin
1.4 本研究的目的和意义
1.5 本研究的策略
2 材料和方法
2.1 材料
2.1.1 菌株和质粒
2.1.2 培养基
2.1.3 缓冲液及试剂
2.1.4 NTG 的称量
2.2 方法
2.2.1 碱裂解法提取大肠杆菌质粒
2.2.2 大肠杆菌质粒的快速提取
2.2.3 大肠杆菌感受态的制备
2.2.4 热激转化的方法
2.2.5 胶回收的方法
2.2.6 链霉菌接合转移的方法
2.2.7 PCR 扩增目的片段程序
2.2.8 预萌发实验
2.2.9 诱变处理过程
2.2.10 质粒构建
2.2.11 HPLC 检测方法
3 结果
3.1 质粒构建结果
3.1.1 pSR3的构建及酶切验证
3.1.2 pEX152的构建及酶切验证
3.1.3 双报告基因质粒的构建验证
3.2 3585:pEX152的显色试验 35
3.3 粗测70116:pSET152-PccaR-XN 的卡那霉素抗性上限
3.4 NTG 诱变重组菌70116:pSET152-PccaR-XN
3.5 显色法筛选高产菌
3.5.1 96孔板法初筛
3.5.2 HPLC 检测克拉维酸产量
3.5.2.1 70116与70116:pSET152-PccaR-XN 发酵比较
3.5.2.2 HPLC 检测诱变后菌株发酵液的克拉维酸产量
3.5.2.3 高产菌株的验证
3.6 高通量筛选方法的建立
3.6.1 滤纸片法筛选高产菌预实验
3.6.1.1 摸索反应体系
3.6.1.2 克拉维酸标准品的鉴定
3.6.2 高通量筛选方法即96孔板法
3.6.2.1 96孔板法的酶液初次摸索及标准曲线的测定
3.6.2.2 96孔板法筛选
3.6.2.3 样品的 HPLC 检测
3.6.3 HPLC 检测得到的克拉维酸标准品的标准曲线
3.7 高通量筛选方法的检测
4 讨论
参考文献
第二部分 : 报告基因法比较两种放线菌启动子的活性
1 前言
1.1 链霉菌启动子区域的普遍特征
1.2 同典型的原核生物启动子相似的链霉菌启动子
1.3 具有特定结构和功能的链霉菌启动子
1.4 红霉素抗性基因启动子和 Psf 启动子
1.5 报告基因
1.6 本实验的目的及意义
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 菌种与质粒
2.1.2 培养基和抗生素
2.1.3 试剂和酶
2.2 方法
2.2.1 一般操作
2.2.2 引物设计
2.2.3 链霉菌测量干重的方法
2.2.4 质粒构建
2.2.5 卡那霉素抗性梯度实验
2.2.6 XylE 显色法方法
3 结果
3.1 质粒构建结果
3.1.1.PvuⅡ酶切验证 pKC-psf
3.1.2 EcoR Ⅰ酶切 pSR2
3.1.3 Xba Ⅰ和 Msc Ⅰ酶切验证 pFN113
3.1.4 EcoR Ⅰ酶切 pKC-psf 和 pZW121
3.1.5 酶切验证 pZW221
3.1.6 PCR 扩增 xylE 片段
3.1.7 酶切验证 pEX152
3.1.8 酶切验证 pFX113
3.1.9 酶切验证 pFX152
3.2 卡那霉素抗性梯度实验
3.3 XylE 显色法比较启动子活性
3.4 两个启动子在其他链霉菌中的比较
4 讨论
参考文献

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中图分类: > Q939.124 > 生物科学 > 微生物学 > 微生物分类学(系统微生物学)

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