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CARM1在PC12细胞内与CLOCK的结合及功能性研究

专 业: 生物化工
关键词: PC12细胞 转录调控 生物节律 甲基转移酶1 调节因子 转录活性
分类号: Q555
形 态: 共 68 页 约 44,540 个字 约 2.131 M内容
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内容摘要


CARM1(Coactivator-Associated arginine(R)Methyltransferase1,辅激活因子相关的精氨酸甲基转移酶1)是生物体内一种分布广泛,功能多样的辅调节因子,它具有蛋白精氨酸甲基转移酶活性,在类固醇激素刺激下,能够被SRC-3(Steroid ReceptorCoactivator-3,类固醇受体辅激活因子-3)募集,通过甲基化染色质内组蛋白上特异位点的精氨酸残基而参与调控靶基因的转录过程。

而与SRC-3在结构上十分相似的CLOCK(Circadian Locomotor Output Cycles Kaput,昼夜节律运动输出周期故障)是细胞内进行生物节律调节的核心调控因子,它与BMAL1形成异二聚体结合于下游靶基因的E-box元件上,利用其C末端所带有的乙酰转移酶活性区域修饰启动子上的组蛋白赖氨酸残基,激活下游节律基因的表达,在此过程中是否需要其它辅调节因子的参与,目前的研究还较少。

本研究旨在发现细胞内CARM1与CLOCK的相互作用,以及CARM1对CLOCK潜在的调节能力,进而寻找其参与生物节律调控的证据,为细胞内类固醇激素信号转导途径和生物节律调控体系间的交叉提供一定的理论支持。

实验的具体内容及结果如下:

利用免疫共沉淀实验,在PCI2细胞内,以CAMR1抗体进行免疫沉淀,CLOCK抗体进行免疫印迹,检测两者在内源条件下的结合情况,结果发现CARM1可以与CLOCK发生相互作用,且这一结合作用受血清刺激的影响,在存在血清或不存在血清的情况下,两者的结合有明显差异;另一方面在COS-7细胞内,外源转染HA-CARM1和Flag-CLOCK的真核表达质粒,模拟PC12细胞内实验,以HA抗体进行免疫沉淀,Flag抗体进行免疫印迹,检测两者的结合,结果也发现在外源转染条件下CARM1与CLOCK的结合。

为了检测CARM1和CLOCK在PC12细胞内的分布情况,利用CARM1和CLOCK的抗体进行免疫荧光实验,实验结果显示,正常培养的细胞内,CARM1及CLOCK在细胞核和细胞质内都有分布,且核内相对较多;而当用血清刺激之后,CARM1的分布没有变化,但CLOCK明显向核内聚集。

对于CARM1结合CLOCK的功能性研究,从转录活性和周期性两个方面着手。

首先进行的是双荧光素酶报告基因实验检测CARM1对于CLOCK转录活性影响,结果显示正常的Gal4DBD-CLOCK能大大提高报告基因系统的表达,而当向其中同时转染如CARM1质粒后,报告基因系统的表达明显下降,说明CARM1能够抑制CLOCK的转录活性;随后进行的CARM1与CLOCK周期性结合情况分析,发现在血清刺激后,CARM1和CLOCK的结合随时间先增高后降低,在大约20小时处为峰值,存在一定周期性。

综上,本研究首次发现了CARM1与CLOCK这两个分属于类固醇受体信号转导途径与生物节律调节途径的蛋白因子问的相互作用,将细胞内相对独立的两种调控体系联系起来,并进一步证实两者的结合在血清刺激后会表现出一定的周期性,且CARM1会抑制CLOCK的转录活性,暗示其可能是一种潜在的生物节律调控因子..……

全文目录


摘要
引言
1 文献综述
1.1 生物节律因子CLOCK概述
1.1.1 CLOCK的基本结构
1.1.2 CLOCK调控生物节律
1.2 转录因子CARM1概述
1.2.1 CARM1及PRMT家族的结构特点
1.2.2 CARM1的生理功能
1.3.1 选题依据
1.3.2 研究内容
2 CARM1与CLOCK相互作用的鉴定
2.1 引言
2.2 仪器与试剂
2.2.1 仪器
2.2.2 试剂
2.3 实验方法
2.3.1 细胞培养
2.3.2 免疫共沉淀
2.3.3 哺乳动物细胞外源转染
2.3.4 Western blotting
2.3.5 考马斯亮蓝法测蛋白浓度
2.4 结果与讨论
2.4.1 在PC12细胞内CARM1可与CLOCK结合
2.4.2 HA-CARM1和Flag-CLOCK能在COS-7细胞内相互作用
2.5 小结
3 PC12细胞内CARM1与CLOCK的分布水平
3.1 引言
3.2 仪器与试剂
3.2.1 仪器
3.2.2 试剂
3.3 实验方法
3.3.1 细胞培养
3.3.2 免疫荧光
3.4 结果与讨论
3.4.1 免疫荧光检测CARM1及CLOCK的核质分布
3.5 小结
4 CARM1对CLOCK转录活性的影响
4.1 引言
4.2 仪器与试剂
4.2.1 仪器
4.2.2 试剂
4.3 实验方法
4.3.1 细胞培养
4.3.2 哺乳动物外源转染
4.3.3 双荧光素酶报告基因检测
4.4 结果与讨论
4.4.1 双荧光素酶报告基因检测结果
4.5 小结
5 CARM1与CLOCK相互作用的周期性鉴定
5.1 引言
5.2 仪器与试剂
5.2.1 仪器
5.2.2 试剂
5.3 实验方法
5.3.1 细胞培养
5.3.2 免疫共沉淀
5.3.3 Western blotting
5.3.4 考马斯亮蓝法测蛋白浓度
5.4 结果与讨论
5.4.1 CARM1与CLOCK结合具有周期性
5.5 小结
结论
参考文献

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中图分类: > Q555 > 生物科学 > 生物化学 > 酶 > 转换酶(转移酶)

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