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对磷酸原激酶家族中精氨酸激酶与肌酸激酶抑制作用的研究

专 业: 生物化工
关键词: 精氨酸激酶 抑制动力学 肌酸激酶 丙烯酰胺
分类号: Q55
形 态: 共 128 页 约 83,840 个字 约 4.01 M内容
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内容摘要


磷酸原激酶家族成员不但广泛存在于动物体内,而且对于生物能的代谢、贮存和利用发挥了至关重要的作用。

近年来,磷酸原激酶的抑制作用研究越来越受到关注,不同来源的磷酸原激酶家族成员因其在能量代谢中的重要地位而成为研究酶抑制作用的靶目标。

因此,对磷酸原激酶,尤其是两种最为常见的磷酸原激酶--精氨酸激酶(AK)和肌酸激酶(CK)的结构与功能的研究,以及对其抑制作用机制的研究,可以使人们(1)更为深入地理解生物体内的能量代谢过程;(2)针对有害昆虫体内AK有效抑制剂的筛选,可以为开发环境友好的杀虫剂提供新的途径;(3)深入研究疾病或衰老等发生过程中磷酸原激酶CK的活性抑制机理。

磷酸原激酶是一个具有高度保守性的家族,能够可逆地催化磷酸原(如磷酸肌酸和磷酸精氨酸)的转磷酰基反应。

肌酸激酶(Crealine Kinase,ATP:Creatinephosphotransferase,EC2.7.3.2)和精氨酸激酶(Arginine Kinase,ATP:

Argininephosphotransferase,EC2.7.3.3)是磷酸原激酶家族中两个重要成员。

本文主要研究了作为存在于自然界的重要重金属离子之一的Ag+对精氨酸激酶(AK)的抑制作用和丙烯酰胺对肌酸激酶(CK)的影响。

同时,还考察了锌离子对HBCK活力的影响,以及研究了甘氨酸和脯氨酸对锌离子引起HBCK聚沉的缓解作用。

对文献中精氨酸激酶分离方法进行了改进,从中国对虾(Chinese Shrimp,Fenneropenaeus chinensis)肌肉中分离纯化得到了精氨酸激酶。

采用SephacrylS-300分子筛层析和DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析进一步得到了纯化的AK样品,测得其分子量为43,000Da,酶对腺苷三磷酸(ATP)的Km(ATP)值为2.38,对精氨酸(Arg)的Km(Arg)值为2.62,最适pH为8.2.论文还研究了Ag+对中国对虾精氨酸激酶(AK)活性的影响。

结果表明,Ag+以剂量依赖的方式抑制AK的活性(IC50=15μM)。

动力学研究表明,Ag+对AK的抑制是可逆的,其抑制类型为非竞争性抑制(Ki=2.8μM)。

荧光光谱结果表明,在导致AK失活的浓度范围内,Ag+并不引起AK三级结构发生明显变化,但圆二色光谱显示其二级结构发生了轻微的变化。

这些实验结果说明AK的活性部位具有柔性,其活性的完全丧失早于分子整体结构发生的明显变化。

本课题的开展有助于揭示Ag+对AK的抑制机理,并能使我们更深入地了解Ag+对精氨酸激酶的影响。

丙烯酰胺广泛用于工业生产,在日常生活的食物烹饪和加工过程中也可能产生。

丙烯酰胺对人体有害,人脑型肌酸激酶(HBCK)被认为是丙烯酰胺的重要作用靶标之一。

因此,论文通过酶活力测定、光谱学技术和分子模拟等方法研究了丙烯酰胺对HBCK的作用,探究了丙烯酰胺对HBCK的活性和结构的影响以及两者之间可能的结合位点。

与兔源CK(RBCK)相比,HBCK的活性在浓度低数倍的丙烯酰胺作用下可被完全抑制,并且在丙烯酰胺诱导的失活过程与结构变化方面表现出不同的特征。

丙烯酰胺的结合位点位于CK分子的N-端结构域和C-端结构域之间的裂隙之中,谷氨酸(Glu)232是结合的关键性氨基酸残基之一,并认为丙烯酰胺对CK的影响具有同工酶特异性和物种特异性。

另外,论文还研究了锌离子对HBCK活力的影响,结果表明,低浓度的锌离子导致HBCK的失活;高浓度的锌离子可引起HBCK的聚沉,并且发现这种聚沉具有温度、酶浓度及锌离子浓度依赖性。

为此,考察了添加两种渗压剂(osmolytes)(甘氨酸和脯氨酸)对由此引起的HBCK聚沉的缓解作用,结果表明甘氨酸和脯氨酸能够防止聚沉,并且能够帮助部分恢复酶的构象与活力。

如上所述,论文对磷酸原激酶家族的重要成员,精氨酸激酶和肌酸激酶的抑制作用开展了研究,对这两种能量代谢中的关键酶的结构与催化活性在抑制过程中的变化进行了较为详细的探究,为进一步深入研究磷酸原激酶抑制作用的机理以及今后开展相关应用奠定了基础..……

全文目录


摘要
主要符号注释表
目录
第一章 绪论
1.1 引言
1.2 磷酸原激酶的基本情况和基本性能
1.3 磷酸原激酶的作用
1.4 研究磷酸原激酶及其抑制的意义
1.5 目前研究磷酸原激酶及其抑制的进展情况
1.6 在研究磷酸原激酶以及抑制作用方面存在的问题和不足
1.7 本文的研究目的和主要内容
第二章 精氨酸激酶的分离纯化及其性质研究
2.1 引言
2.2 材料和方法
2.2.1 材料
2.2.2 几种缓冲液的配制
2.2.3 AK的分离纯化方法
2.2.4 AK的测活方法
2.3 结果
2.3.1 AK的分离纯化与纯度鉴定
2.3.2 pH对AK酶活性的影响
2.3.3 AK的K_m值测定
2.4 讨论
2.5 本章小结
第三章 银离子对精氨酸激酶的抑制动力学研究
3.1 引言
3.2 材料与方法
3.2.1 材料
3.2.2 AK的纯化
3.2.3 AK酶活力的测定
3.2.4 动力学分析
3.2.5 内源荧光光谱和ANS结合荧光光谱
3.2.6 圆二色光谱
3.3 结果
3.3.1 Ag~+对AK活性的影响
3.3.2 Ag~+对AK三级结构的影响
3.3.3 Ag~+引起的AK二级结构的变化
3.4 讨论
3.5 本章小结
第四章 丙烯酰胺对人脑型肌酸激酶活性和结构的影响
4.1 引言
4.2 材料和方法
4.2.1 材料
4.2.2 HBCK的表达和纯化
4.2.3 HBCK的活性测定
4.2.4 ANS结合荧光光谱
4.2.5 HBCK与丙烯酰胺结合的计算机模拟分析
4.3 结果与讨论
4.3.1 HBCK的克隆表达与分离纯化
4.3.2 丙烯酰胺导致HBCK的失活研究
4.3.3 丙烯酰胺对HBCK三级结构的影响
4.3.4 对HBCK分子上的丙烯酰胺结合位点的对接模拟分析
4.4 本章小结
第五章 渗压剂对锌离子诱导失活的人脑肌酸激酶及聚沉的影响
5.1 引言
5.2 材料与方法
5.2.1 材料
5.2.2 蛋白质浓度及酶活力测定
5.2.3 荧光发射光谱、ANS结合荧光光谱及CD光谱的测定
5.3 结果
5.3.1 锌离子对HBCK的活力影响
5.3.2 HBCK与锌离子作用后的内源荧光发射光谱
5.3.3 HBCK与锌离子作用后的ANS结合荧光
5.3.4 HBCK与锌离子作用后的圆二色光谱
5.3.5 HBCK与锌离子作用后,Gly及Pro对其活力的影响
5.3.6 HBCK与锌离子作用后,Gly及Pro对其ANS结合荧光的影响
5.3.7 温度、锌离子及HBCK浓度对聚沉的影响
5.3.8 Gly及Pro能防止锌离子引起的HBCK聚沉
5.4 讨论
5.5 本章小结
第六章 结论与展望
6.1 结论
6.2 展望
参考文献

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