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pGEX-4T-2-TK原核表达质粒的构建及其表达

专 业: 肿瘤学
关键词: 单纯疱疹病毒 胸苷激酶基因 表达型质粒载体 自杀基因疗法 基因治疗 肿瘤治疗 分子生物学
分类号: R730.59
形 态: 共 56 页 约 36,680 个字 约 1.755 M内容
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内容摘要


目的:

近年来,肿瘤的基因治疗一直是人们研究的热点。

为了探索自杀基因在肿瘤治疗中的应用,本实验选择具有较好安全性,重组后能很好表达的原核表达质粒pGEX-4T-2作为构建重组质粒的载体,以其表达产物能将无毒的前体药物更昔洛韦(GCV)转化成细胞毒性产物(三磷酸更昔洛韦)的自杀基因-单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)作为目的基因,用分子生物学相关技术构建pGEX-4T-2-TK重组质粒,将构建好的重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)内,观察其目的蛋白表达情况及体外对鼻咽癌CNE-2细胞的杀伤作用,为进一步转化入双歧杆菌后能否靶向表达于肿瘤乏氧区的后续实验做准备。

方法:

用小量制备质粒DNA的方法分别提取表达型质粒pGEX-4T-2以及含有TK自杀基因的质粒pORF-HSV-TK,通过PCR方法以质粒pORF-HSV-tk为摸板扩增亡TK基因,设计上下游引物时分别加入限制性内切酶BamHⅠ和SalⅡ酶切点。

纯化后的表达型质粒载体pGEX-4T-2与自杀基因HSV-TK分别用限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ进行双酶切后连接。

将连接好的重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)内,用含氨苄青霉素的LB固体培养基筛选出阳性转化菌菌落,扩增后再提出质粒行双酶切鉴定,PCR鉴定以及送英骏公司进行测序鉴定,将鉴定正确的阳性菌用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导表达后,一部分行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳观察蛋白表达情况,同时另一部分添加终浓度为1mmol\L的更昔洛韦,厌氧罐厌氧培养24h后取细菌悬液10 ml,离心收集上清液,真空干燥,残渣用无菌0.9%生理盐水1ml溶解,由此获得处理液。

同时以培养基、单纯阳性菌处理液组及单纯GCV组作对照,处理方法同上。

各取200μl处理液作用于培养在96孔培养板中的CNE-2细胞,于37℃,5%CO2孵箱中培养24h后,用WST-1法观察各组鼻咽癌细胞存活率。

结果:

(1)挑取抗氨苄青霉素的单个阳性转化菌菌落,扩增后提取重组质粒行双酶切,然后行1%琼脂糖凝胶电泳得到1100kb(HSV-TK)和4900kb(pGEX-4T-2)片断,与预计大小一致。

(2)以提取出的重组质粒pGEX-4T-2-TK为模板,PCR特异性扩增HSV-tk基因,行1%琼脂糖凝胶电泳,可见扩增出的PCR产物大小约1100Kb的条带,与TK基因大小一致。

(3)将pGEX-4T-2-HSVtk重组质粒送Invitrogen公司进行测序鉴定,通过两个测序反应得到两段碱基序列分别为854bp和872bp,去除测序引物并且连接后得到1124bp,将此段连接序列用chromas软件分析示与GENEBANK上公布的原序列一致,无开放读码框架移位及改变,无基因突变。

(4)阳性转化菌经IPTG诱导培养后,行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,较未添加IPTG组可见目的蛋白条带产生,说明构建的原核表达质粒成功,经诱导后可以表达目的蛋白,达到实验要求。

(5)体外WST-1法观察实验组(阳性菌+GCV)CNE-2细胞存活率只有33.65%,而单纯阳性转化菌组及单纯GCV组的存活率分别为88.29%,76.81%,采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析,实验组与各对照组进行组间比较,p<0.05有统计学意义。

采用析因方差分析,单纯阳性菌组与单纯GCV组交互作用后与阳性菌+GCV组相比较,P<0.01,有统计学意义,表明实验组抑瘤结果,不是阳性菌组及GCV组抑瘤结果的简单相加,而是阳性转化菌表达的产物作用于前药GCV,使其磷酸化为对细胞有毒性的三磷酸更昔洛韦,从而大大提高了对鼻咽癌细胞的杀伤作用。

结论:

(1)成功构建pGEX-4T-2-tk重组质粒,经限制性核酸内切酶双酶切鉴定,特异性PCR扩增鉴定,及测序鉴定均证实重组质粒构建成功,经chromas分析软件分析示重组质粒PCR产物序列与GENEBANK上公布的原序列一致,无开放读码框架移位及改变,无基因突变;(2)将构建好的重组质粒成功转入大肠杆菌后自杀基因能表达目的蛋白,阳性菌与GCV共同培养后获得的处理液对CNE-2细胞有明显的抑制作用..……

全文目录


文摘 1
英文文摘 4
论文说明:英汉缩略词对照表 7
前言 10
材料与方法 15
结果 28
讨论 34
结论 39
参考文献 40
综述:双歧杆菌的抗肿瘤作用 46

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中图分类: > R730.59 > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 一般性问题

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