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甘油单-二酰酯脂肪酶基因的克隆和表达

专 业: 生物化工
关键词: 甘油单-二酰酯脂肪酶 克隆 表达 大肠杆菌 毕赤酵母
分类号: Q556  Q78
形 态: 共 73 页 约 47,815 个字 约 2.287 M内容
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内容摘要


本研究以卡门柏青霉-PG3为出发菌株,提取其总RNA,应用RT-PCR反应扩增出860bp左右的片段,核苷酸序列分析表明其与甘油单-双酰酯脂肪酶MDGL基因mdlA一致。

将mdlA基因克隆到原核表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21DE3,经诱导后,重组的脂肪酶在宿主菌中的表达量可达菌体总蛋白量的45.2.重组蛋白包涵体溶解、复性后用Ni~2+组氨酸结合树脂螯合层析柱纯化,聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE显示为单一区带,其相对分子质量为41000。

以橄榄油为底物时没有检测到酶活性,以单硬脂酸甘油脂为底物时酶活性达到13.5U/mL碱滴定法。

为了使mdlA基因在真核细胞中表达,又将mdlA基因插入到分泌表达质粒pPIC9K中,通过电激将线性化的重组质粒整合到毕赤酵母Pichia pastorisGS115中,筛选出His~+Mut~+表型菌株,进一步用G418筛选获得高拷贝转化子,并用PCR方法鉴定。

诱导培养后,SDS-PAGE表明MDGL在毕赤酵母中得到有效表达。

表达产物在温度40℃,pH7.5具有最高活性,其发酵液酶活可达到325U/mL..……

全文目录


第一章 文献综述
1.1 脂肪酶简介
1.2 脂肪酶的微生物生产
1.2.1 脂肪酶产生菌
1.2.2 产脂肪酶菌种的选育
1.2.3 产脂肪酶微生物的筛选
1.2.4 利用微生物发酵生产脂肪酶
1.3 脂肪酶的结构与催化机理
1.4 脂肪酶作用的底物特异性
1.4.1 脂肪酸特异性
1.4.2 位置特异性
1.4.3 立体结构特异性
1.5 脂肪酶活力的测定
1.5.1 定量法
1.5.2 定性法
1.6 脂肪酶的固定化
1.7 脂肪酶的蛋白质工程改造
1.7.1 理性设计
1.7.2 定向进化
1.8 脂肪酶的应用
1.8.1 生产单甘酯
1.8.2 皮革生产
1.8.3 加酶洗涤剂
1.8.4 食品工业的应用
1.8.5 利用脂肪酶拆分手性化合物
1.8.6 油脂改性
1.8.7 环境污染治理
1.9 小结
第二章 甘油单-二酰酯脂肪酶基因的克隆与序列分析
2.1 前言
2.2 实验材料
2.2.1 菌种
2.2.2 质粒
2.2.3 工具酶
2.2.4 化学药品及试剂盒
2.2.5 PCR引物
2.2.6 主要仪器
2.2.7 培养基
2.3 实验方法
2.3.1 碱裂解法微量制备质粒DNA
2.3.2 CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞
2.3.3 质粒DNA的转化
2.3.4 琼脂糖凝胶电泳
2.3.5 目的条带的回收
2.3.6 卡门柏青霉总RNA提取
2.3.7 RNA的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳
2.3.8 cDNA第一链的合成
2.3.9 CTAB法提取卡门柏青霉基因组DNA
2.3.10 基因序列的PCR扩增
2.4 实验结果
2.4.1 卡门柏青霉-PG3总RNA的提取
2.4.2 成熟肽基因的PCR扩增
2.4.3 卡门柏青霉-PG3脂肪酶基因组DNA的提取
2.4.4 以总DNA为模板的PCR扩增
2.4.5 PCR产物的克隆、鉴定
2.5 基因序列分析
2.5.1 核苷酸及其编码的蛋白质序列
2.5.2 MDGL与其它脂肪酶一级结构的同源性比较
2.6 小结
第三章 mdlA基因在大肠杆菌中的表达
3.1 前言
3.2 实验材料
3.2.1 菌种与载体
3.2.2 化学药品
3.2.3 主要仪器
3.3 实验方法
3.3.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳
3.3.2 目的基因在大肠杆菌中的诱导表达
3.3.3 包涵体蛋白的变性、复性
3.3.4 NaOH滴定法测定脂肪酶活性
3.4 实验结果
3.4.1 表达质粒的构建
3.4.2 重组质粒的酶切鉴定
3.4.3 在大肠杆菌中的诱导表达
3.4.4 生物学活性的测定
3.5 小结
第四章 mdlA基因在毕赤酵母中的表达
4.1 前言
4.2 实验材料
4.2.1 菌株与质粒
4.2.2 化学药品及材料
4.2.3 主要仪器
4.2.4 培养基
4.3 实验方法
4.3.1 使用不同缓冲液的双酶切反应
4.3.2 毕赤酵母GS115感受态细胞制备
4.3.3 毕赤酵母GS115的电击转化
4.3.4 毕赤酵母基因组提取方法
4.3.5 Mut~+表型重组酵母的诱导表达实验
4.3.6 对硝基苯酚显色法p-NPL法测定脂肪酶活性
4.3.7 重组脂肪酶对甘油三酰酯脂肪酶水解脂肪的影响
4.4 实验结果
4.4.1 mdlA基因在毕赤酵母中的表达
4.4.2 发酵条件优化
4.4.3 表达产物对甘油三酰酯脂肪酶催化脂肪水解的影响
4.5 小结
第五章 结论
参考文献
附录

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中图分类: > Q556 > 生物科学 > 生物化学 > 酶 > 水解酶
其他分类: > Q78 > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程(遗传工程)

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