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人细胞色素P450 1A2、2C9、2E1和3A4基因克隆及表达

专 业: 微生物与生化药学
关键词: 细胞色素P450 药物代谢酶 基因克隆 异源表达
分类号: R971
形 态: 共 89 页 约 58,295 个字 约 2.788 M内容
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内容摘要


本课题旨在通过基因克隆和异源表达的方法,获得由特定基因所表达的重组细胞色素P450药物代谢酶,为以后的酶活性鉴定和酶代谢功能研究奠定基础。

1目的基因的克隆与重组病毒的构建

分别以国外获赠的含有CYP1A2、CYP2E1、CYP3A4基因的质粒为模板进行PCR扩增目的基因,同时以人肝细胞cDNA为模板PCR扩增CYP2C9基因。

对于CYP1A2和CYP2E1,分别在5 端添加EcoRⅠ酶切位点,3 端添加KpnⅠ酶切位点,对于CYP2C9和CYP3A4,分别在5 端添加SalⅠ酶切位点,3 端添加KpnⅠ酶切位点。

将目的基因克隆至pCMV-Myc载体上并进行DNA测序,结果证实已获得完整正确的目的基因。

将经过双酶切的目的基因片段插入经同样双酶切后的pFastBacl转座载体中,重组质粒转化入大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,转座后产生重组粘粒DNA(Bacmid)。

将该重组粘粒转染Sf9细胞后,即产生重组杆状病毒。

2重组蛋白表达

将重组杆状病毒以0.01-0.1的MOI值感染生长良好的Sf9细胞来扩增重组病毒,使病毒滴度达到10~8pfu/mL或更高,然后将重组病毒以MOI..……

全文目录


中文摘要
英文缩略词表
前言
实验材料
实验方法
1. 基本实验操作
2. CYP1A2基因克隆及表达实验方法
3. CYP2C9基因克隆及表达实验方法
4. CYP2E1基因克隆及表达实验方法
5. CYP3A4基因克隆及表达实验方法
实验结果
1. CYP1A2基因的克隆和表达
2. CYP2C8基因的克隆和表达
3. CYP2E1基因的克隆和表达
4. CYP3A4基因的克隆和表达
讨论
小结
参考文献
文献综述
附录

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