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cNHX1基因的融合、功能鉴定和对转基因草莓耐盐性影响的研究

专 业: 果树学
关键词: SOEing cNHX1 功能 细胞程序性死亡 表达特性 耐盐性
分类号: S601  S668.4
形 态: 共 110 页 约 72,050 个字 约 3.446 M内容
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内容摘要


盐胁迫是影响中国农业生产的一个重要因素,近年来,通过组成性表达植物Na<+>/H<+> antiporter基因,获得了耐盐能力显著提高的多种转基因植物,表明通过这种策略培育耐盐作物品种具有广阔的前景。

但是目前关于果树植物NHX基因功能和转NHX基因果树植物的研究仍然是空白。

该研究通过SOEing技术,将来源于果树植物(柑橘)的Na<+>/H<+> antiporter基因片段融合为一个完整基因,并利用多基因突变的酵母菌株分析了cNHX1基因的细胞定位、离子区域化功能、离子特异性和对1.5M NaCl诱导的酵母细胞程序性死亡的抑制作用,证明cNHX1基因为具有功能的植物液泡膜Na<+>/H<+> antiporter基因。

同时该研究对转cNHX1基因的弗吉尼亚草莓外源基因表达特点和整合情况及盐胁迫条件下某些生理指标的变化进行了研究,为利用cNHX1基因转化果树植物,获得耐盐的转基因植株做了初步尝试……

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英文缩略表
中文摘要
英文摘要
1引言
1.1盐胁迫对植物的毒害作用
1.1.1盐胁迫对植物生长的影响
1.1.2盐胁迫对植物营养吸收的影响
1.1.3活性氧的产生
1.1.4对蛋白质功能和合成的影响
1.2 Na+吸收机制研究进展
1.2.1 K+通道
1.2.2 NSCC通道
1.2.3 LCT基因
1.2.4 Na+的渗漏吸收机制
1.2.5植物中存在特异性Na+吸收机制
1.2.6 HKT基因作用的复杂性
1.2.7 Cl-的吸收机制
1.3盐胁迫信号的识别和传递
1.3.1盐胁迫信号的识别
1.3.2下游信号传递
1.4植物对Na+胁迫的响应机制
1.4.1控制Na+的运输
1.4.2 Na+的木质部回流
1.4.3 Na+的重新循环
1.4.4 Na+的外排
1.4.5 Na+向液泡的区域化
1.4.6合成细胞相容性物质
1.4.7清除活性氧的保护作用
1.4.8调节因子
1.4.9胁迫抵抗相关蛋白
1.4.10水孔蛋白
1.5本研究的目的和意义
2材料和方法
2.1菌株、质粒、酶和试剂
2.1.1菌株
2.1.2质粒
2.1.3酶及生化试剂
2.1.4植物材料
2.2基因的拼接
2.2.1基因融合引物
2.2.2基因融合方法
2.2.3 SOEing PCR扩增产物的回收
2.2.4 SOEing PCR扩增产物的酶切
2.2.5 DNA片段的连接
2.2.6大肠杆菌的转化
2.2.7融合cNHX1基因的鉴定
2.2.8融合cNHX1基因的序列测定
2.2.9融合cNHX1基因的修复
2.3 cNHX1基因的序列分析
2.4 cNHX1基因酵母表达载体的构建
2.4.1 pUCNHX克隆载体的构建和鉴定
2.4.2 pUGNHX载体的构建
2.5酿酒酵母的转化和鉴定
2.5.1酿酒酵母的电激转化
2.5.2酵母转化子的鉴定
2.6 cNHX1基因在酵母细胞中的定位
2.7 cNHX1基因功能的鉴定
2.7.1 Drop assay
2.7.2 NaCl对酵母生长曲线的影响
2.7.3离子含量的测定
2.8 PCD抑制效应实验
2.8.1PCD抑制效应的荧光显微镜观察(DAPI染色法)
2.8.2细胞核碎裂比率统计
2.8.3 Clonigenic survival assay(CFU)
2.8.4酵母细胞凋亡的流式细胞分析(PI染色法)
2.9 cNHX1基因转化‘弗吉尼亚’草莓
2.9.1 cNHX1基因植物表达载体(pRNHX)的构建
2.9.2 cNHX1基因植物转化工程菌的获得
2.9.3草莓转化
2.9.4转化植株的分子鉴定
2.9.5转基因草莓植株的RT-PCR检测
2.10转基因植物cNHX1基因表达量和拷贝数的荧光定量PCR检测
2.10.1引物设计和评价
2.10.2 PCR反应体系退火温度的优化
2.10.3 PCR反应体系Mg2+浓度的优化
2.10.4 cDNA稀释浓度的确定
2.10.5荧光定量PCR实验方法
2.10.6标准曲线和熔解曲线的制作
2.10.7 cNHX1基因表达量的定量分析
2.10.8转基因拷贝数的荧光定量分析
2.10.9转基因植株的Southern blot检测
2.11转基因植株部分生理指标的分析
2.11.1K+、Na+和Cl-含量测定
2.11.2 MDA含量的测定
2.11.3可溶性蛋白含量的测定
2.11.4 Pro含量的分析
3结果与分析
3.1 cNHX1基因的融合
3.1.1 cNHX1片段的融合
3.1.2 SOEing PCR产物的克隆和酶切鉴定
3.1.3融合cNHX1基因的序列测定
3.1.4融合cNHX1基因的序列的修复
3.2 cNHX1基因的序列分析
3.2.1 cNHX1基因的功能结构域预测
3.2.2 cNHX1基因的跨膜区域预测
3.2.3 cNHX1基因的同源比较分析
3.2.4 cNHX1基因的系统发生分析
3.3 cNHX1基因离子区域化功能的鉴定
3.3.1酵母表达载体的构建
3.3.2酵母转化
3.3.3酵母转化子的鉴定
3.3.4 cNHX1蛋白的细胞定位
3.3.5 cNHX1基因离子区域化功能的鉴定
3.3.6 cNHX1基因对高盐诱导的酵母细胞程序性死亡的抑制作用
3.4转cNHX1基因草莓植株的获得
3.4.1含cNHX1基因植物双元表达载体的构建
3.4.2三亲交配
3.4.3草莓植株的转化和转化苗的获得
3.5利用Real Time PCR分析转基因植株拷贝数和表达量
3.5.1 RNA的提取
3.5.2定量PCR引物的设计及评价
3.5.3 PCR反应体系的优化
3.5.4 Mg2+浓度的优化
3.5.5 cDNA稀释浓度的确定
3.5.6熔解曲线分析
3.5.7标准曲线的制作
3.5.8转cNHX1基因草莓植株cNHX1基因表达水平的定量分析
3.6转基因植株cNHX1基因拷贝数的定量分析
3.6.1标准曲线的制作
3.6.2转cNHX1基因草莓植株cNHX1基因表达水平的定量
3.6.3 Southern杂交
3.7转基因草莓植株部分生理指标的分析
3.7.1盐胁迫条件下Na+,K+和Cl-含量分析
3.7.2盐胁迫条件下Pro含量分析
3.7.3盐胁迫条件下蛋白质含量分析
3.7.4 MDA含量分析
4讨论
4.1 cNHX1基因的融合
4.2 cNHX1蛋白的定位
4.3 cNHX1蛋白的Topology模型
4.4 cNHX1基因的离子区域化功能和底物特异性
4.5 cNHX1基因的PCD抑制作用
4.6 cNHX1基因对植物PCD的可能影响
4.7定量分析转基因草莓外源基因表达水平
4.7.1 Real Time PCR体系的可靠性
4.7.2外源基因表达的定量分析
4.8外源基因拷贝数的定量分析
4.9转基因草莓的耐盐能力
5结论
5.1 cNHX1基因是AtNHX1和2的同源基因
5.2 cNHX1基因定位于液泡膜
5.3 cNHX1基因具有Na+/H+antiporter活性
5.4 cNHX1蛋白抑制了NaCl诱导的酵母细胞程序性死亡
5.5不同转基因株系cNHX1基因表达水平和拷贝数存在差异
5.6转cNHX1基因草莓植株提高了耐盐能力
参考文献
附录

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中图分类: > S601 > 农业科学 > 园艺 > 一般性问题 > 生物学原理
其他分类: > S668.4 > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 多年生草本果类

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