优秀研究生学位论文题录展示

铜绿假单胞菌生物膜与藻酸盐相关基因研究

专 业: 内科学传染病
关键词: 铜绿假单胞菌 生物膜 藻酸盐 亚胺培南 西司他丁 基因表达
分类号: R51
形 态: 共 83 页 约 54,365 个字 约 2.601 M内容
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内容摘要


铜绿假单胞菌是造成我国医院和社区获得性感染及重症监护病房感染最主要的非发酵革兰氏阴性杆菌,耐药性强,临床治疗棘手。

随着各种侵入性医疗器械的广泛应用,由铜绿假单胞菌生物膜造成的医用材料相关感染的难治性已被临床广泛关注,而由铜绿假单胞菌引起的慢性难治性下呼吸道感染也与生物膜形成密切相关。

细菌生物膜是指附着在有生命或无生命物体表面的由细菌自身产生的胞外多聚基质包裹的细菌细胞结构群体,它是细菌的一种具有自我保护性的生长模式。

与浮游细菌相比,生物膜细菌对抗菌药物的抗性可提高10~1000倍,现有药物难以清除生物膜。

生物膜细菌高度耐药的机制尚未阐明,目前认为是多个因素的综合作用造成的,包括细菌胞外多聚基质的屏障作用、生物膜细菌生理上的不均质性及生物膜结构上的不均质性。

铜绿假单胞菌产生的胞外多聚基质主要包含胞外多糖、蛋白质和DNA,其中胞外多糖的重要成分——藻酸盐在其生物膜形成和结构方面的作用还存在争议。

以往的研究认为藻酸盐在铜绿假单胞菌生物膜形成和结构方面具有重要作用,但最近Wozniak等人提出藻酸盐不是非黏液型铜绿假单胞菌生物膜胞外多聚基质的主要成分,对其生物膜形成和结构不起作用;而Stapper等人则认为藻酸盐对铜绿假单胞菌生物膜形成和结构有一定影响但非决定因素。

由于各研究组所采用的实验方法具有差异,结果难以对比,目前对这一问题尚无定论。

亚胺培南/西司他丁泰能是临床治疗重症感染经验用药的首选抗生素之一,最近有报道指出亚胺培南/西司他丁可诱导非黏液型铜绿假单胞菌PAO1藻酸盐合成增加,促进其生物膜形成和加厚,对亚胺培南/西司他丁在铜绿假单胞菌重症感染并有合并生物膜感染可能时的应用提出了疑问。

对抗生物膜感染的方法除了研发新的抗生素外,从生物膜形成的各个阶段着眼来阻止生物膜形成是目前研究的热点,最近的研究表明胞外多聚基质中的DNA成分为细菌生物膜形成所必需。

本课题关注的问题包括:1藻酸盐对黏液型和非黏液型铜绿假单胞菌生物膜形成和结构的影响;2亚胺培南/西司他丁泰能能否在铜绿假单胞菌重症感染并有合并生物膜感染可能时使用;3从抑制胞外多聚基质中的DNA成分着手寻找新的治疗铜绿假单胞菌生物膜感染的途径。

本课题以黏液型铜绿假单胞菌PA17和非黏液型铜绿假单胞菌标准菌株PAO1为研究对象,对以上三方面的问题进行了研究。

目的:研究藻酸盐对黏液型铜绿假单胞菌PA17和非黏液型铜绿假单胞菌PAO1生物膜形成和结构的影响;观察亚胺培南/西司他丁泰能对铜绿假单胞菌生物膜形成及藻酸盐合成相关基因algD表达的影响,为临床用药提供实验依据;检测DNaseI对铜绿假单胞菌生物膜形成和成熟生物膜的影响,为临床治疗铜绿假单胞菌生物膜感染提供新思路。

方法:改良平板培养法建立黏液型铜绿假单胞菌PA17和非黏液型铜绿假单胞菌标准菌株PAO1的体外生物膜模型;半定量RT-PCR方法检测浮游状态和生物膜形成不同时间点PA17和PAO1的藻酸盐合成相关基因algD、algU和algR的表达,进行统计学分析;PCR方法扩增PA17和PAO1的藻酸盐合成调节基因mucA全序列并测序比较;克隆PAO1的野生型mucA基因并转入PA17中表达,观察表达野生型mucA基因的PA17的algD表达和生物膜形成过程;液体稀释法检测PA17和PAO1对常用抗菌药物的最低抑菌浓度;扫描电镜观察1倍和10倍最低抑菌浓度的亚胺培南/西司他丁对PA17和PAO1生物膜形成的影响;半定量RT-PCR方法检测干预过程中不同时间点PA17和PAO1的藻酸盐相关基因algD的表达情况;扫描电镜观察不同浓度DNaseI对PA17和PAO1生物膜形成及成熟生物膜的影响。

结果:PA17于第6天形成成熟生物膜,PAO1于第3天形成成熟生物膜,两者结构均为薄膜状。

浮游状态时,PA17的algD、algU和algR表达均较PAO1高,t检验显示差异具有统计学意义。

生物膜形成过程中algD和algU均在成熟生物膜形成时表达最高,algR在生物膜形成的第24h表达最高。

单因素方差分析结果显示生物膜形成的不同时间点algD、algU和algR表达的差异均有统计学意义。

两独立样本秩和检验显示生物膜形成过程中PAO1和PA17间上述基因表达的差异无统计学意义。

PA17的mucA基因第166-333位核苷酸缺失,第342位A→G;PAO1的mucA基因序列与Genebank中公布的序列完全相同。

克隆PAO1的mucA基因并转入PA17中表达,表达重组质粒PA17浮游状态的algD表达下降,其生物膜形成速度居PAO1和PA17之间,8h时即可出现不可逆性黏附,与PAO1相同,成熟生物膜形态为薄膜状。

对PA17用1倍和10倍最低抑菌浓度的亚胺培南/西司他丁干预时,第3dalgD表达较未干预组分别增加1.5和3.4倍,生物膜形态无明显变化;第6dalgD表达分别增加0.38和0.78倍,PA17分散的黏附于盖玻片,没有形成生物膜。

对PAO1用1倍和10倍最低抑菌浓度的亚胺培南/西司他丁干预时,第24halgD表达较未干预组分别增加2.5和3.5倍,生物膜形态无明显变化;第3d分别增加0.7和2.1倍,1倍最低抑菌浓度亚胺培南/西司他丁作用组仍可看到少量微菌落存在,10倍最低抑菌浓度作用组仅见散在的细菌;第6d分别增加1.5和2.1倍,两个浓度组均只见数个细菌黏附于盖玻片。

25U/ml的DNaseI即可抑制黏液型和非黏液型铜绿假单胞菌生物膜形成且分解成熟生物膜,100U/ml的DNaseI可完全阻止其生物膜形成并彻底分解成熟生物膜。

结论:藻酸盐主要在生物膜形成过程中微菌落分化为成熟生物膜的阶段发挥作用,但不是决定性因素;黏液型铜绿假单胞菌PA17和非黏液型铜绿假单胞菌标准菌株PAO1的生物膜结构均为薄膜状可能与PA17和PAO1生物膜形成过程中藻酸盐合成相关基因表达水平接近相关;PA17含新型mucA基因突变,这种新突变类型的mucA基因与PAO1的野生型mucA基因对铜绿假单胞菌生物膜结构的影响一致;野生型mucA基因不仅参与藻酸盐合成,还可增强生物膜形成初期细菌的不可逆黏附能力,而PA17的新型mucA基因突变可减弱该能力;亚胺培南/西司他丁虽可诱导algD表达上调从而使铜绿假单胞菌藻酸盐合成增加,但若从生物膜形成早期开始使用,仍可抑制和破坏生物膜形成;DNaseI可抑制生物膜形成和分解成熟生物膜,其作用呈浓度依赖性,且不受铜绿假单胞菌表型限制..……

全文目录


英文缩略词表
中文摘要
英文摘要
前 言
第一部分 :铜绿假单胞菌生物膜形成中藻酸盐相关基因表达和序列研究
材料与方法
材料
实验方法
结果
讨论
参考文献
第二部分 :亚胺培南/西司他丁对铜绿假单胞菌生物膜和algD基因表达的影响
材料与方法
结 果
讨论
参考文献
第三部分 :DNaseI对铜绿假单胞菌生物膜的影响
材料和方法
结 果
讨论
参考文献
结论
综 述细菌生物膜的研究进展
附 录

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中图分类: > R51 > 医药、卫生 > 内科学 > 传染病

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