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Photofrin-Herceptin偶联物对肿瘤细胞株的体外杀伤效应研究

专 业: 肿瘤学
关键词: 光免疫治疗 光敏剂 赫赛汀 免疫偶联物
分类号: R73
形 态: 共 46 页 约 30,130 个字 约 1.441 M内容
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内容摘要


【目的】研究Photofrin-Herceptin偶联物对HER-2表达阳性肿瘤细胞的特异性杀伤作用,为进一步的光免疫治疗奠定基础。

【方法】1.分别对SK-BR-3、MCF-7、A549三种肿瘤细胞株进行传代培养,用流式细胞术测定各细胞株细胞表面HER-2表达率; 2.将131I-Herceptin超滤,用纸层析进行组分分析以验证超滤法去除商品Herceptin中所含赋形剂及防腐剂的可行性; 3.将商品Herceptin用超滤法进行预处理,用碳二亚胺(EDCI)将光敏剂Photofrin与单抗Herceptin偶联,并用薄层层析对Photofrin-Herceptin偶联物进行鉴定,然后分别使用凝胶过滤、超滤、盐析及亲和层析的方法对Photofrin-Herceptin偶联物的纯化进行尝试; 4.用酶联免疫法测定Photofrin-Herceptin偶联物免疫活性,并用MTT法检测其对不同HER-2表达率的肿瘤细胞株的体外杀伤作用。

【结果】1.传代培养的SK-BR-3、MCF-7、A549细胞生长状态良好,其在普通光镜下的照片与ATCC提供的照片相比无明显差异。

流式细胞术(本院血液科实验室)测定SK-BR-3细胞、MCF-7细胞和A549细胞表面HER-2表达率,分别为:

99.04%、7.55%和0.44%。

2.131I-Herceptin超滤前Rf值=0的百分数为77.1%,与总的截留率78.2%相近,说明131I标记的Herceptin通过超滤,截留液中基本上只有被131I标记的单抗了,原液中其它成分几乎都被滤走。

Rf值=0.1和0.2时,所占总放射性活度百分比为2.2,为小分子物质结合131I所致。

超滤后截留液纸层析结果,Rf值=0的百分数为96.8%,显示截留液中成分比较单一,超滤除杂效果满意。

对比两次超滤后的滤过液纸层析结果可以发现,滤过液中所含绝大部分为游离131I及与131I结合的小分子化合物,真正大分子化合物极少,体现超滤的截留效果较好。

3.薄层层析结果显示:

Herceptin位于原点,普通灯光下无色,紫外灯下呈蓝色,Rf值接近于0;Photofrin在普通灯光下显示一红色长带,从原点一直拖到10cm处,远处较深;Photofrin-Herceptin偶联物溶液在普通灯光下也显示红色条带,但主要集中在原点,紫外灯下原点呈蓝色。

4.用葡聚糖凝胶SephadexG-25做为分离基质不能去除偶联物中游离的Photofrin,Photofrin可能与SephadexG-25发生结合,95%的乙醇清洗层析柱时出现填料溶解现象。

超滤纯化法显示Photofrin水溶液基本上不能透过截留分子量30,000的超滤膜。

盐析结果显示在50%饱和硫酸铵溶液中Photofrin可以同蛋白质一样析出,而向这种析出液中加入少量醇溶液后,可以使液体变得澄清。

亲和层析的结果显示Photofrin容易与proteinG结合,并且在洗脱液的作用下发生了产气化学反应。

5.酶联免疫吸附试验显示Photofrin-Herceptin偶联物的免疫活性较Herceptin降低,前者约为后者的50%。

6.体外杀伤实验结果显示:

在所含光敏剂和\或单抗剂量相同的条件下,Photofrin-Herceptin偶联物对SK-BR-3细胞的杀伤作用明显强于Photofrin,Herceptin,Photofrin+Herceptin组(p<0.05);Herceptin对细胞几乎没有杀伤作用,但光镜下可见其对于SK-BR-3细胞的生长状态有明显影响;单用Photofrin或Photofrin和Herceptin的混合物,两条细胞存活率曲线几乎重合(p>0.05),表明Photofrin+Herceptin对细胞的杀伤作用是由Photofrin所发挥的,其中的Herceptin基本没有影响Photofrin的作用;Photofrin-Herceptin偶联物对该细胞株的IC50约为1.5μg\ml,Photofrin+Herceptin的IC50约为6.μg\ml,它们的IC50之比为0.23,可见Photofrin-Herceptin偶联物对该细胞株的杀伤作用较偶联前明显增强。

Photofrin-Herceptin偶联物对MCF7细胞的杀伤作用略强于P和P+H组(p<0.05),P组与P+H组之间差异无统计学意义(p>0.05)。

结果显示Herceptin对该细胞株没有杀伤作用,Photofrin-Herceptin偶联物对该细胞株的IC50约为6.00μg\ml,Photofrin+Herceptin的IC50约为6.μg\ml,两者IC50之比为0.91,可见偶联物对MCF-7细胞株(HER-2±)的杀伤作用较偶联前略有增强,但与HER-2表达强阳性的SK-BR-3细胞株相比明显降低。

Photofrin-Herceptin偶联物对A549细胞的杀伤作用与Photofrin和Photofrin+Herceptin组无显著差异-(p>0.05),而各实验组与Herceptin组相比都有显著性差异(p<0.05)。

结果显示Herceptin对于A549细胞株亦无明显杀伤作用,光镜下细胞生长状态良好;Photoffin-Herceptin、Photofrin+Herceptin、Photofrin对该细胞株的IC50均约为5.0μg\ml左右,Photofrin-Herceptin与Photofrin+Herceptin之间的IC50比值接近1.0。

可见,对于HER-2表达阴性的A549细胞株,Photofrin-Herceptin偶联物对其杀伤作用较偶联前无明显差异。

结合前两项结果,可以认为Photofrin-Herceptin偶联物对肿瘤细胞的杀伤作用具有特异性。

另外,从Photofrin对上述三种细胞株不同的IC50可以看出,不同细胞株对Photofrin的敏感性不同。

【结论】1.SK-BR-3、MCF-7、A549三种肿瘤细胞株的HER-2表达率符合实验设计要求,可以用于本实验。

2.用超滤的方法对商品Herceptin进行预处理,可以基本去除其中所含的赋形剂及防腐剂成分,从而避免或减少了其对偶联过程的影响。

3.用碳二亚胺法进行偶联切实有效,但Photofrin-Herceptin偶联物免疫活性较偶联前有所下降。

4.Photofrin-Herceptin偶联物对HER-2表达阳性的肿瘤细胞的杀伤作用较Photofrin、Herceptin及Herceptin与Photofin的混合物明显增强,对于HER-2表达阴性的肿瘤细胞杀伤效果无明显差异,其杀伤作用具有特异性和靶向性,存在进一步光免疫治疗的实验基础。

5.光敏剂Photofrin理化性质复杂,纯化Photofrin-Herceptin偶联物较为困难..……

全文目录


文摘
英文文摘
前言
第一部分 SK-BR-3、MCF-7、A549细胞株培养及HER-2表达鉴定
材料和方法
结果
讨论
第二部分 Photofrin-Herceptin偶联物的制备及鉴定
第一章 Herceptin的偶联前准备
材料和方法
结果
讨论
第二章 偶联物的制备及鉴定
材料和方法
结果
讨论
第三部分 Photofrin-Herceptin偶联物免疫活性的测定
材料和方法
结果
讨论
第四部分 Photofrin-Herceptin偶联物体外抗肿瘤细胞活性的检测
材料与方法
结果
讨论
附图
第五部分 Photofrin-Herceptin偶联物纯化的尝试
材料与方法
结果
讨论
参考文献
文献综述 光动力疗法的免疫作用
中英文对照缩略词表

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中图分类: > R73 > 医药、卫生 > 肿瘤学

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