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苹果醇酰基转移酶基因MdAAT2参与酯类香气合成调控机理的研究

专 业: 果树学
关键词: 苹果 酯类香气 醇酰基转移酶 基因表达 酯类合成 基因调控
分类号: S601  S661.1
形 态: 共 118 页 约 77,290 个字 约 3.697 M内容
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内容摘要


苹果MalusdomesticaBorkh.是世界上最重要的鲜食和加工果品之一。

香气作为苹果品质的重要指标在一定程度上影响了消费者的购买欲望。

挥发性酯类物质是构成成熟苹果特征香气最重要的成分之一。

为了研究苹果酯类合成与调控机制,我们从金冠苹果中分离出酯类合成途径最末端的关键酶-醇酰基转移酶基因MdAAT2,并对它的表达模式和调控机制进行了深入研究。

主要结果如下:1、苹果酯类挥发性成分提取与分析对比了三种不同类型的SPME纤维头提取苹果酯类物质的效果。

结果发现,PDMS/DVB65μmBondedSPME纤维头较适合苹果酯类挥发性成分的萃取,优化萃取条件为:

50℃萃取30分钟。

SPME-GCMS分析发现:

丁酸己酯、乙酸己酯、乙酸丁酯、2-甲基丁酸己酯和己酸己酯是采后成熟金冠苹果中较重要的酯类物质。

2、MdAAT2基因分离及其特征利用同源序列设计简并引物,通过RT-PCR和RACE-PCR技术分离了乔纳金苹果和金冠苹果果实中的醇酰基转移酶基因,分别命名为MdAAT1和MdAAT2.其全长分别为:1,639bp和1,628bp,二者在氨基酸水平上的同源性为94.26%,GenBank注册号分别为AY512893和AY517491.序列分析表明,MdAAT2大部分氨基酸区域为亲水结构,其中含有2个推测的跨膜区,分别在148aa和174aa。

序列比对发现MdAAT2也含有BAHD基因家族和其它已知醇酰基转移酶基因共有的氨基酸保守区:

HXXXD和FGWG。

聚类分析发现,MdAAT2蛋白与同属蔷薇科仁果类的梨果实醇酰基转移酶蛋白亲缘关系最近,而与柠檬、草莓、玫瑰花等醇酰基转移酶蛋白亲缘关系较远。

结果表明,我们已经分离到苹果醇酰基转移酶基因。

3、MdAAT2基因在E.coli中的表达将MdAAT2基因编码区克隆到原核表达载体pET32a-c+在OrigamiBDE3中表达了部分可溶的融合蛋白,酶活检测发现重组表达载体菌株醇酰基转移酶活性显著高于对照,表明MdAAT2基因参与了苹果酯类物质合成。

4、MdAAT2基因的表达分析RT-PCR发现MdAAT2在金冠果实中特异表达,在红星果实和花中特异表达,表明MdAAT2在不同器官的表达特性有品种间差异。

免疫荧光原位杂交和Westernblot发现MdAAT2蛋白主要在苹果果皮组织中表达。

进一步分析发现MdAAT2蛋白可能在细胞质中表达,这与LOCSVMpsi程序预测亚细胞定位结果相符。

Northern和Westernblot分析发育期与采后成熟期金冠苹果果皮中MdAAT2表达模式发现,MdAAT2蛋白表达调控是在转录水平。

酶活分析发现在采后成熟后期,MdAAT2mRNA和蛋白表达仍维持较高水平,但酶活却呈显著下降趋势,表明MdAAT2蛋白可能存在翻译后修饰。

果实65DAFB之前在苹果果皮中可以检测到MdAAT2的表达和酶活,但未检测到酯类物质,而反式-2-丁酸己烯酯和反式-2-己酸己烯酯仅在95DAFB中可以检测到。

将正己醇、正丙醇和顺式-2-己烯醇、反式-2-己烯醇分别添加到65DAFB和115DAFB果实组织圆片,可以促进相应酯类成分的合成。

表明醇类底物的的浓度和种类是影响苹果酯类挥发性成分组成和浓度的重要因素之一。

1-MCP处理采后常温存放苹果果实抑制了乙烯和酯类物质的合成,抑制了MdAAT2的表达,1-MCP+ETH可以部分恢复果实的乙烯和酯类合成,诱导MdAAT2的表达。

表明,乙烯参与了采后苹果果实中酯类物质合成的调控。

5、水杨酸SA、乙烯利ETH和茉莉酸甲酯MeJA对1-MCP结合低温冷藏14周后苹果酯类合成恢复的调控机制

1-MCP结合低温冷藏14周后的苹果果实恢复到20℃后研究其酯类合成恢复能力发现,SA,ETH和MeJA可以不同程度的诱导MdAAT2的表达。

RT-PCR分析乙烯合成与信号转导途径相关基因发现,三种信号物质对MdAAT2的调控需要通过诱导内源乙烯合成和激活乙烯信号转导途径来实现,其中MdETRl在乙烯信号感受中起到了关键调控作用,并影响了其下游MdAAT2基因的表达。

SA、ETH和MeJA与对照相比均显著的诱导了Single1-MCP处理中MdAAT2的表达,但酯类物质恢复的种类和浓度均不同,这表明这三种信号物质还可能参与了酯类物质合成上游途径的调控。

分析发现,SA、ETH和MeJA对贮藏后苹果直链酯类合成上游途径的调控可能是通过调控LOX和ADH酶活影响了酯类物质的组成和浓度。

此外,SA和MeJA可能还诱导了苯基丙酸类合成途径等其它代谢途径,使处理后果实产生了苯甲酸己酯。

6、烟草和番茄果实酯类代谢工程35S::MdAAT2转基因烟草增强了其酯类合成的能力,并且有新的酯类成分在叶片中检出,但却没有检测到苹果中的特征酯类物质。

番茄果实特异表达MdAAT2未检测到酯类挥发性成分和浓度的改变。

在转基因烟草和番茄果实均可检测到MdAAT2的表达和较高的醇酰基转移酶活性,这进一步说明底物的种类、浓度决定了转基因植株中酯类物质的组成和浓度。

总之,MdAAT2基因调控了苹果酯类挥发性成分的合成,但酯类挥发性成分的组成和浓度却受底物种类和浓度等因素的影响..……

全文目录


摘要
英文摘要
英文缩写符号及其中英文对照表
1前言
2.材料与方法
3结果与分析
3.1苹果酯类挥发性成分分析
3.2苹果醇酰基转移酶基因MdAAT的分离
3.3苹果醇酰基转移酶基因MdAAT的序列分析
3.4 MdAAT2在大肠杆菌中的表达、抗体制备及效价测定
3.5 MdAAT2重组蛋白功能鉴定
3.6 MdAAT2的表达特性及挥发性酯类成分分析
3.7苹果贮后酯类挥发性成分的恢复及调控机制
3.8 MdAAT2基因在烟草中超表达对烟草挥发性成分代谢的影响
3.9 MdAAT2基因在番茄果实特异表达对番茄果实香气成分的影响
4讨论
5结论
参考文献
附录 常用缓冲液的配制

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中图分类: > S601 > 农业科学 > 园艺 > 一般性问题 > 生物学原理
其他分类: > S661.1 > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 仁果类

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