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人noggin基因克隆及真核表达载体构建

专 业: 神经病学
关键词: 基因克隆 表达载体 微管蛋白启动子 胚胎发育 神经诱导功能
分类号: R51
形 态: 共 48 页 约 31,440 个字 约 1.504 M内容
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内容摘要


目的Noggin基因是1992年California大学的Harland,R.M.和Smith,W.C.从非洲爪蟾的胚胎中分离出来的,由于将其mRNA注入爪蟾的胚胎可使其头部明显增大,因此得名。

此后发现该基因在胚胎发育中有重要神经诱导作用,尤其是诱导外胚层的背侧发育1.Noggin作为胚胎发育的重要基因,在进化过程中相当保守,在不同的物种间具有高度同源性。

它涉及许多的发育过程,如神经管的形成和关节软骨的形成。

作为一种内源性神经诱导信号,它的作用不仅局限于胚胎期,在成年哺乳动物CNS与外周神经系统也可检测到noggin基因的表达。

此外,noggin基因亦是目前在体内与体外均被证实有神经诱导作用的神经诱导剂。

其神经诱导功能主要是通过拮抗骨形成蛋白bonemorphogeneticprotein-4,BMP4的作用实现的。

对于神经细胞的体外诱导分化研究和实验国内外均有广泛报道,但通过构建人Noggin基因载体并用其诱导分化的研究尚属领先。

Talpha-1微管蛋白启动子是一种神经细胞特异性启动子,有选择的在神经干细胞和不成熟的神经细胞内表达。

为了进一步研究noggin基因的神经诱导功能和在细胞分化过程中的表达情况,本研究利用基因工程的方法构建pCS2+Tα1-Noggin载体。

使我们可以很便利的研究noggin在活体细胞和组织的生物学特性基因表达、信号转导、代谢活动等,为下一步进行神经移植或基因治疗打下基础。

方法应用逆转录多聚酶链式反应RT-PCR技术,从正常人胎脑组织中扩增出noggincDNA,并将其连接到T载体上,经酶切鉴定无误后,送公司进行DNA测序鉴定,用HindIII和XbaI酶切质粒pMD18-T-noggin与质粒pCS2+Tα1-GFP,回收酶切产物,用T4DNA连接酶作用后将连接产物转化感受态大肠杆菌株DH5a,挑菌落提取质粒后进行重组体测序鉴定。

经酶切、PCR、DNA序列分析鉴定确定无误,载体构建成功。

结果在正常人胎脑组织中克隆的noggincDNA片段经测序鉴定,克隆基因序列同GenBank收录人noggincDNA序列基因存取号NM005450用DNAMAN软件进行同源性分析显示99.97%同源。

并以此基因与pCS2+Tα1成功构建真核表达载体。

结论本项研究从正常人胎脑组织中克隆noggin基因,并用基因工程的方法构建了noggin的神经细胞特异性启动子表达载体pCS2+Tα1-Noggin..……

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中图分类: > R51 > 医药、卫生 > 内科学 > 传染病

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