优秀研究生学位论文题录展示

CRT-HPV重组DNA疫苗和RNA干扰技术对HPV的抑制作用研究

专 业: 内科学传染病学
关键词: 尖锐湿疣 人乳头瘤病毒 基因分型 钙网蛋白 重组DNA疫苗 小干扰RNA
分类号: R51  R752.53  R730.261
形 态: 共 157 页 约 102,835 个字 约 4.919 M内容
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内容摘要


尖锐湿疣Condylomaacuminatum,CA是我国发病率最高的性传播疾病之一,其临床上顽固难治,极易复发。

人乳头瘤病毒Humanpapillomavirus,HPV是其病原体,迄今已有130多种亚型被鉴定,其中HPV6和11型是CA的高感染型。

RNA干扰RNAinterference,RNAi是指双链RNA在生物体细胞内对序列特异性mRNA的抑制作用,此过程具有极强的特异性和高效性。

这种选择性的基因沉默作用可通过siRNAsmallinterferingRNA,siRNA而实现。

因此本文拟进行以下三部分的研究以期解决一些HPV感染的诊断、免疫治疗和特异性基因沉默的问题,为HPV感染相关疾病的防治提供一些实验依据和参考。

第一部分不同引物介导的聚合酶链反应对人乳头瘤病毒的快速检测与分型PCR技术是具有高度敏感性和特异性的扩增和检测基因的一种手段,将其用于HPV检测能通过观察扩增基因条带的大小来诊断和分型。

1.1PCR反应检测HPV型别取104例经过临床及病理确诊的CA组织和12例阴茎包皮环切术组织以液氮研磨,经酚/氯仿/异戊醇抽提提取DNA,稀释后作为模板,分别用HPV6、11、16、18型特异性引物、通用引物MY09/11、GP5+/6+经聚合酶链反应PCR进行扩增。

有1例经通用引物检测均呈阳性,但HPV6、11、16和18型特异性引物扩增为阴性,可能为HPV6/11/16/18型别以外的感染,必要时可进一步作鉴定。

1.2比较两对通用引物检测HPV的敏感性取HPV6b/11型阳性质粒以始量10ng/μl分别以10倍倍比稀释成5个浓度,分别采用通用引物MY09/11和GP5+/6+进行PCR扩增,以能观察到阻性条带所对应的最低浓度为本实验的灵敏度。

第二部分融合DNA疫苗CRT180/HPV6bE7的免疫学特性和抗血管作用研究利用现代分子生物学技术,我们构建了表达CRT1-180aa片段和CRT1-120aa片段分别与HPV6bE7相连的HPVDNA重组疫苗,并在表达HPV6bE7阳性的B16黑色素瘤细胞株和动物模型上研究其免疫效应和抗血管作用。

2.1重组质粒的构建和表达HPV6bE7的细胞株的建立以质粒pUC19/HPV6b/11为模板扩增HPV6b/11E6/E7全长基因并插入真核表达载体pcDNA3.1-GFP而形成重组体pcDNA3.1-HPV6b/11E6/E7-GFP。

2.2DNA重组疫苗对小鼠T细胞和NK细胞的调节作用以质粒抽提试剂盒大量提取和纯化免疫用重组质粒和pcDNA3.1空载体。

2.3体外CTL杀伤活性的测定以重组质粒免疫小鼠的脾脏和淋巴结的单个核细胞作为效应细胞和表达HPV6bE7的B16细胞作为靶细胞进行体外CTL反应。

2.4脾淋巴细胞IL-2和IFN.γ的分泌水平变化将效应细胞与靶细胞E:

T=20:1共孵育后取其上清液以ELISA法测IL-2和IFN-γ浓度水平,通过绘制倍比稀释的标准曲线与样品比较来推算各样本的浓度。

结果表明CRT180或CRT120与HPV6bE7相连的疫苗能通过上调细胞因子分泌水平来加强特异性免疫反应。

2.5抗血管活性检测C57BL/6雌性小鼠,6-8周龄,体重16-20克,每组3只,共10组。

取上述抽提的各组质粒DNA各100μg及PBS100μl分别免疫各组小鼠,7天后同样剂量加强免疫一次。

2.6肿瘤生长抑制实验为了验证建立的各组DNA疫苗对HPV6bE7基因的荷瘤组织的出瘤时间和肿瘤大小的影响。

荷瘤治疗实验:

C57BL/6雌性小鼠,6-8周龄,18-20g重,每组6只,共7组。

荷瘤抑制实验:

C57BL/6雌性小鼠,6-8周龄,18-20g重,每组6只,共7组。

每组小鼠大腿肌肉注射各组DNA质粒100μg或PBS100μl,7天重复一次共3次。

末次免疫5天后于每只小鼠右侧背部皮下接种1×105B16/HPV6bE7的细胞。

CRT180和CRT180/HPV6bE7均诱导出类似的抗血管作用至少能部分提示CRT120-180aa可能是具有抗血管活性作用的主要区域。

在建立的所有的DNA疫苗中,CRT180/HPV6bE7能产生最有效的E7-特异性免疫反应和抗血管作用,因此,其有希望作为新颖的治疗手段用于HPV6b感染CA和相关疾病。

第三部分小干扰RNA对人乳头瘤病毒6bE6的特异性基因沉默作用RNAi是动物和植物体内靶向于同源基因的siRNA所引起的序列特异性的mRNA降解的过程。

早期基因E6在HPV生长周期中起了重要作用,故将RNAi作用介导的HPVE6特异性敲除运用于HPV感染相关疾病的基因疗法中不失为一种合理可行的策略。

全文小结1.通用引物GP5+/6+检出微量HPVDNA的敏感度高于引物MY09/11.GP5+/6+通用引物结合型特异性引物可为临床上检测尖锐湿疣HPV型别提供方便易行的选择。

2.分别克隆了CRT180/120和HPV6b/11E6/E7cDNA,成功构建了一组重组真核表达质粒并命名为pcDNA3.1-CRT180/HPV6bE7、pcDNA3.1-CRT120/HPV6bE7、pcDNA3.1/HPV6bE6、pcDNA3.1/HPV6bE7、pcDNA3.1/HPV11E6、pcDNA3.1/HPV11E7。

3.通过重组质粒转染细胞株,建立稳定有效表达HPV6b/11E6/E7基因的转染细胞株。

4.体内实验中pcDNA3.1-CRT180/HPV6bE7和pcDNA3.1-CRT120/HPV6bE7DNA融合疫苗直接肌肉注射免疫小鼠后,能显著上调CD8+T细胞,TCRγδT细胞,诱导出较pcDNA3.1-HPV6bE7组及其它对照组更强HPV6bE7特异性的CTL反应及更高的IL-2和IFN-γ分泌水平。

5.重组DNA疫苗pcDNA3.1-CRT180/HPV6bE7和pcDNA3.1-CRT180在动物体内能对bFGF诱导的新生血管的生成有明显的抑制作用;

6.在肿瘤治疗实验中,CRT180/HPV6bE7和CRT180能显著抑制荷瘤的大小。

在肿瘤抑制实验中,CRT180/HPV6bE7较其他组能明显延缓荷瘤的形成时间和生长速率以及肿瘤重量。

7.在构建的所有重组DNA疫苗中,CRT180/HPV6bE7能诱导最强的E7-特异性免疫应答和血管抑制作用,能部分抑制肿瘤生长。

8.CRT180/HPV6bE7或CRT180在抑制血管增生方面优于CRT120/HPV6bE7或CRT120,提示抑制血管的功能片段存在与CRTaa120-180片段上。

9.特异性siRNA-HPV6bE6和质粒载体shRNA-HPV6bE6转染细胞后均能对同源靶基因选择性地抑制而不影响无关基因影响的表达。

10.微量浓度1nM的特异性siRNA-HPV6bE6就可诱导选择性高效性的基因沉默,siRNA的抑制作用至少能维持4天。

11.特异性siRNA-HPV6bE6和质粒载体shRNA-HPV6bE6能在表达HPV6bE6的小鼠荷瘤中抑制靶基因的表达。

瘤体内注射优于尾静脉注射..……

全文目录


缩略语及中英文对照
中文摘要
英文摘要
研究背景
常用实验仪器设备、材料与试剂
第一部分 不同引物介导的聚合酶链反应对HPV的快速检测与分型
第二部分 表达CRT与HPV6bE7重组DNA疫苗的免疫学特性研究
前言
材料
方法
结果
结论
讨论
参考文献
第三部分 小干扰RNA对HPV6bE6基因的沉默作用
创新点
综述一 热休克蛋白在人乳头瘤病毒感染发病和治疗中的意义
综述二 小干预RNA在某些病毒性疾病的研究现状

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中图分类: > R51 > 医药、卫生 > 内科学 > 传染病
其他分类: > R752.53 > 医药、卫生 > 皮肤病学与性病学 > 病毒性皮肤病
其他分类: > R730.261 > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 一般性问题

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