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4-羟基苯基维甲酰胺抗肝癌作用及其机制研究

专 业: 内科学传染病学
关键词: 肝癌 细胞凋亡 羟基苯基维甲酰胺 抗肿瘤活性
分类号: R51  R735.7  R979.1
形 态: 共 77 页 约 50,435 个字 约 2.413 M内容
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内容摘要


肝癌是一种严重威胁人类生命的恶性肿瘤,临床死亡率极高。

早期肝癌病人通常采用外科手术或肝移植来治疗。

目前,70%的病人由于肝脏肿瘤的快速生长以及肝脏状况的不断恶化而不易进行手术治疗,而且肝癌属于一种对全身性化疗有抗性作用的肿瘤,因此寻找新的抗肝癌化疗药物或新的治疗方案成为全世界肿瘤研究者的关注热点。

4-羟基苯基维甲酰胺N-hydroxyphenylretinamide,4-HPR,Fenretinide是19世纪70年代人工合成的维甲酸类化合物,与传统维甲酸类化合物相似,可有效用于多种肿瘤的化学预防。

此外,4-HPR由于其独特的组织分布、诱导凋亡活性及较小的毒性有别于传统维甲酸类化合物,可用于多种肿瘤的化学治疗。

近年来国外使用4-HPR合用其它类化疗药物的一些临床试验研究表明4-HPR可明显协同其它类化疗药物的抗癌作用,同时副作用较少,可长期服用,是一种非常有潜力的抗肿瘤药物。

4-HPR的确切抗肿瘤机制尚未完全阐明,研究证实,4-HPR的体外诱导细胞凋亡途径可能是多通路的,包括维甲酸RA受体依赖性通道,活性氧簇的大量产生以及神经酰胺通路的激活等等。

本文旨在研究4-HPR对人肝癌细胞株的体内外抑制效应,并探讨其可能的作用机制,为拓展其临床应用提供依据。

目的:

研究4-HPR在体内外的抗肝癌作用,并探讨其作用机制。

方法:

分别采用MTT法和流式细胞术评价4-HPR体外抑制肝癌细胞活性及量效关系;应用流式细胞术检测4-HPR诱导Bel7402细胞发生凋亡的时效关系;采用裸小鼠皮下种植模型,观察4-HPR对荷人肝癌Bel7402裸小鼠的整体实验治疗作用;采用Westernblotting方法检测4-HPR对Bel7402细胞p53,Bcl-2,Bax,Pro-caspase,XIAP,PARP等蛋白表达水平;采用JC1和DCFDA染料法研究4-HPR对Bel7402细胞内ROS和线粒体膜电位的影响;采用HPLC-MS/MS观察4-HPR对Bel7402细胞内神经酰胺含量的影响;采用抗氧化剂Piceatannol和Pan-Caspase抑制剂Boc-d-fmk研究4-HPR的作用环节,探讨其对肿瘤细胞的存活、凋亡、神经酰胺的合成和PARP表达水平等影响作用,进一步确定4-HPR抑制肝癌细胞生长的分子作用机制。

结果:1、4-HPR对3种人肝癌细胞株的体外抑制作用:

将细胞与药物共同孵育72小时后,用MTT法测得4-HPR对人肝癌Bel-7402、Smmc-7721和HepG-2细胞的IC50值分别为12.7μM、12.5μM和13.9μM。

2、4-HPR诱导人肝癌Bel-7402细胞凋亡作用:

用15.0μM的4-HPR分别处理Bel-7402细胞12h,24h和48h,并设溶剂对照,收集各组细胞,用流式细胞术检测细胞的凋亡率。

结果显示,溶剂对照组的自发凋亡率为3%,随着4-HPR作用时间的延长,细胞凋亡率分别为7%12h、24%24h和40%48h。

3、4-HPR对人肝癌Bel-7402细胞的实验治疗作用:

4-HPR对裸小鼠体内Bel-7402肿瘤细胞的生长具有明显的抑制作用,且呈剂量依赖性。

在给药过程中4-HPR25、50和100mg/kg组的裸小鼠体重基本不变,但给药21天后抑瘤率分别达到38.9%、45.8%和58.3%。

4、4-HPR对Bel-7402细胞凋亡相关蛋白表达量的影响:

用15.0μM4-HPR分别处理Bel-7402细胞12,24和48h,并设对照,收集各组细胞,提取蛋白,用Western印迹法检测p53、Bcl-2、Bax、Procaspase-3和PARP蛋白表达量的变化。

结果显示,随给药时间的延长,Bel-7402细胞的p53表达显著增加,Bcl-2和Bax表达量的比值显著下降,在给药48h后Procaspase-3蛋白和XIAP的表达量降低减少,而PARP出现活性裂解片段。

5、Piceatannol对4-HPR诱导Bel-7402细胞凋亡的影响:

2μg/mlPiceatannol可降低4-HPR诱导肝癌细胞内神经酰胺和ROS含量,抑制4-HPR诱导肝癌细胞线粒体膜电位的下降,抑制4-HPR引起的PARP的裂解,从而抑制4-HPR诱导的Bel-7402细胞凋亡,增加肝癌细胞的存活率。

6、Boc-d-fmk对4-HPR诱导Bel-7402细胞凋亡的影响:

40μMBoc-d-fmk可抑制4-HPR引起的PARP的裂解,从而抑制4-HPR诱导的Bel-7402细胞凋亡。

讨论和结论:1、我们的实验证实4-HPR对人肝癌细胞离体和在体均有抑制作用,并进一步证实其抗肝癌作用是通过诱导细胞凋亡产生的。

2、野生型p53是一种强有力的肿瘤抑制基因,它可以通过多种途径参与细胞凋亡的调控,如下调Bcl-2基因,上调Bax等基因促进凋亡,通过死亡信号受体蛋白途径诱导凋亡,还可直接刺激线粒体释放活性氧而引发凋亡。

当p53接受信号刺激后,可激活Bax基因,使Bax和Bcl-2量的表达失去平衡,从而触发细胞凋亡。

本研究表明,在4-HPR作用48h后,细胞内p53和Bax蛋白的表达明显增高,Bcl-2蛋白的表达有所降低,且Bcl-2与Bax的蛋白表达量比例显著下降。

该结果提示由4-HPR引起Bel-7402细胞的凋亡与p53相关。

3、Caspase是在细胞凋亡中起作用的一组同源性蛋白,Caspase-3的活化在细胞凋亡信号转导过程中起核心作用,是细胞凋亡过程中的关键蛋白激酶和主要效应因子。

大多数触发细胞凋亡的因素,均需通过Caspase-3介导的信号传导途径。

做为Caspase-3的作用底物,PARP活性片断的出现是Caspase途径被激活的重要证据。

我们的实验结果显示,用4-HPR处理过的Bel-7402细胞中Caspase-3的表达量明显升高,并在48小时处出现PARP的活性裂解片断。

同时凋亡抑制蛋白家族成员XIAP的表达量也有显著的下调,而XIAP可以抑制Caspase-3的激活。

我们实验发现,Caspase抑制剂Boc-d-fmk可抑制4-HPR引起的PARP的裂解,从而抑制4-HPR诱导的Bel-7402细胞凋亡。

因此我们认为,Caspase家族的激活是4-HPR诱导肝癌细胞凋亡的作用机制之一。

4、Piceatannol具有抗氧化作用,可抑制ROS产生。

我们实验发现,Piceatannol可降低4-HPR诱导肝癌细胞内神经酰胺和ROS含量,抑制4-HPR诱导肝癌细胞线粒体膜电位的下降,抑制4-HPR引起的PARP的裂解,从而抑制4-HPR诱导的Bel-7402细胞凋亡,增加肝癌细胞的存活率。

因此,促进线粒体相关ROS含量途径也是4-HPR诱导肝癌细胞凋亡的作用机制之一。

综上所述,我们实验证实,4-HPR效诱导人肝癌细胞凋亡而发挥抗肿瘤活性,其作用机制可能与激活p53、caspase通路和线粒体相关的ROS途径有密切关系。

在体和离体实验证实,4-HPR有抗肝癌活性,值得在临床进一步实验以确证疗效..……

全文目录


中文摘要
英文摘要
1引言
2、材料与仪器
3、方法
4、结果
5、讨论
参考文献
综述 4-羟基苯基维甲酰胺抗肿瘤活性及机制研究进展

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中图分类: > R51 > 医药、卫生 > 内科学 > 传染病
其他分类: > R735.7 > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤
其他分类: > R979.1 > 医药、卫生 > 药学 > 药品

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