优秀研究生学位论文题录展示

牛血清白蛋白变性复性过程及其部分折叠中间体的研究

专 业: 生物化工
关键词: 牛血清白蛋白 变性 复性 中间态 聚集体 荧光光谱法
分类号: Q591.2
形 态: 共 68 页 约 44,540 个字 约 2.131 M内容
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内容摘要


本文应用荧光相图法和高效疏水色谱研究脲和盐酸胍诱导牛血清白蛋白变性过程及其复性过程的路径,捕捉变性、复性过程中存在的部分折叠中间态;应用高效体积排阻色谱和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE研究在脲和盐酸胍变性牛血清白蛋白复性过程中聚集体的形成及成因。

本论文的研究结果将为研究蛋白质折叠机理,建立统一的蛋白质折叠模型奠定基础。

荧光相图法研究牛血清白蛋白变性和复性过程,捕捉部分折叠中间态。

结果表明:

脲诱导牛血清白蛋白变性过程中,当有还原剂存在时,牛血清白蛋白直接从天然态转变为去折叠态,没有中间态存在;当无还原剂存在时,存在一个部分折叠中间态。

盐酸胍诱导牛血清白蛋白变性过程,在有还原剂和无还原剂的条件下都符合“四态模型”,存在两个中间态。

但形成中间态所需的盐酸胍浓度不同。

非还原盐酸胍变性牛血清白蛋白的复性过程中存在两个复性中间态;非还原脲变性牛血清白蛋白的复性过程中存在一个复性中间态。

而还原脲和盐酸胍变性牛血清白蛋白的复性过程中都存在三个部分折叠中间态,分四步进行。

用色谱法对非还原和还原脲变性牛血清白蛋白体外折叠中间体及复性聚集体进行了分离。

发现对于非还原脲变性牛血清白蛋白,在高效疏水色谱上进行复性,发现其再折叠过程中存在一个部分折叠中间态,它的保留时间比天然牛血清白蛋白长,因此比天然牛血清白蛋白的疏水性要强。

在体积排阻色谱柱中能成功恢复其天然构象,复性过程中无聚集体存在。

对于还原脲变性牛血清白蛋白,在疏水色谱上形成聚集体,无法成功复性。

在体积排阻色谱柱中也大部分以聚集体的形式存在。

用非还原和还原SDS-聚丙烯酰胺电泳研究脲变性牛血清白蛋白在脲溶液中稀释复性时聚集体形成的原因。

发现非还原脲变性牛血清白蛋白在稀释复性过程中由于分子间二硫键的错配形成聚集体。

还原变性牛血清白蛋白在稀释复性过程中也会形成聚集体,当复性液中脲浓度很低时,会形成沉淀。

经电泳分析这些聚集体是由于疏水性很强的还原变性牛血清白蛋白分子间的疏水作用导致变性蛋白质分子大量聚集、沉淀。

综合以上实验结果可以得出以下结论:

Ⅰ对于牛血清白蛋白的变性过程,还原脲变性过程符合“两态模型”;非还原脲变性过程符合“三态模型”;而牛血清白蛋白的非还原和还原盐酸胍变性过程都符合“四态模型”。

Ⅱ对于牛血清白蛋白的复性过程,非还原脲变性牛血清白蛋白的复性过程符合“三态模型”;非还原盐酸胍变性牛血清白蛋白的复性过程符合“四态模型”;脲和盐酸胍还原变性牛血清白蛋白的复性过程都存在三个部分折叠中间态。

Ⅲ脲非还原变性牛血清白蛋白的复性过程中,存在一个复性中间态,其疏水性比天然牛血清白蛋白强。

在其稀释复性过程中,由于分子间二硫键错配牛血清白蛋白分子形成聚集体。

Ⅳ在脲还原变性牛血清白蛋白的复性过程中,由于还原变性牛血清白蛋白具有很强的疏水性,在其稀释复性过程中,牛血清白蛋白分子通过分子间疏水作用形成聚集体,甚至沉淀..……

全文目录


中文摘要
第一章 前言
1.1 蛋白质折叠的研究
1.2 蛋白质折叠的机制
1.2.1 热力学与动力学控制学说
1.2.2 多维能量景观学说
1.2.3 蛋白质折叠机制假说
1.3 蛋白质多肤链的折叠模型
1.4 蛋白质的变性
1.5 蛋白质复性
1.6 蛋白质的复性技术
1.6.1 稀释复性
1.6.2 辅助因子和添加复性技术
1.6.3 反向微团中的蛋白再折叠
1.6.4 双水相复性法
1.6.5 三相法
1.6.6 二硫键的正确对接
1.6.7 色谱法复性
1.6.7.1 凝胶排阻色谱SEC
1.6.7.2 疏水色谱HIC
1.6.7.3 离子交换色谱IEC
1.6.7.4 亲和色谱AFC
1.7 复性过程的监测方法
1.8 本研究的内容、目的与意义
参考文献
第二章 荧光检测法对牛血清白蛋白变性复性过程研究
2.1 理论基础
2.1.1 蛋白质的内源荧光
2.1.2 荧光分析法
2.1.3 相图法Phrase Diagrams
2.2 实验部分
2.2.1 仪器
2.2.2 试剂与材料
2.2.3 实验方法
2.2.3.1 非还原变性和还原变性牛血清白蛋白的制备
2.2.3.2 牛血清白蛋白的荧光发射图谱
2.2.3.3 脲和盐酸胍诱导细胞色素C去折叠的荧光相图
2.2.3.4 脲和盐酸胍诱导牛血清白蛋白去折叠的荧光相图
2.2.3.5 脲和盐酸胍变性牛血清白蛋白复性过程的荧光相图
2.3 实验结果
2.3.1 脲诱导牛血清白蛋白去折叠的过程的荧光发射图谱
2.3.2 盐酸胍诱导牛血清白蛋白去折叠的过程的荧光发射图谱
2.3.3 脲和盐酸胍诱导细胞色素C去折叠的荧光相图
2.3.4 无还原剂存在时脲诱导牛血清白蛋白去折叠的荧光相图
2.3.5 有还原剂存在时脲诱导牛血清白蛋白去折叠的荧光相图
2.3.6 无还原剂存在时盐酸胍诱导牛血清白蛋白去折叠的荧光相图
2.3.7 有还原剂存在时盐酸胍诱导牛血清白蛋白去折叠的荧光相图
2.3.8 脲非还原变性牛血清白蛋白复性过程的荧光相图
2.3.9 脲还原变性牛血清白蛋白复性过程的荧光相图
2.3.10 盐酸胍非还原变性牛血清白蛋白复性过程的荧光相图
2.3.11 盐酸胍还原变性牛血清白蛋白复性过程的荧光相图
2.4 讨论
2.4.1 脲诱导牛血清白蛋白去折叠过程
2.4.2 盐酸胍诱导牛血清白蛋白去折叠过程
2.4.3 牛血清白蛋白去折叠过程
2.4.4 牛血清白蛋白的变性与复性过程
2.4.5 还原剂对蛋白质变性和复性过程的影响
2.4.6 脲和盐酸胍的变性机制
参考文献
第三章 疏水色谱法折叠变性牛血清白蛋白研究
3.1 理论基础
3.1.1 蛋白分子中的疏水作用力
3.1.2 疏水色谱的折叠机理
3.2 实验部分
3.2.1 仪器
3.2.2 试剂与材料
3.2.3 实验方法
3.2.3.1 天然、非还原变性与还原脲变性牛血清白蛋白的制备
3.2.3.2 蛋白含量的测定-Bradford法
3.2.3.3 用疏水色谱复性非还原变性牛血清白蛋白
3.2.3.4 用疏水色谱复性还原变性牛血清白蛋白
3.3 结果与讨论
3.3.1 疏水色谱复性非还原变性牛血清白蛋白
3.3.2 疏水色谱复性还原变性牛血清白蛋白
参考文献
第四章 体积排阻色谱法研究变性牛血清白蛋白复性过程中聚集体的形成
4.1 基本原理
4.1.1 凝胶过滤复性的原理
4.1.2 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE
4.2 实验部分
4.2.1 仪器
4.2.2 试剂与材料
4.2.3 实验方法
4.2.3.1 天然、非还原变性与还原脲变性牛血清白蛋白的制备
4.2.3.2 用排阻色谱复性非还原变性牛血清白蛋白
4.2.3.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
4.3 结果与讨论
4.3.1 排阻色谱复性非还原变性牛血清白蛋白
4.3.2 体积排阻色谱复性还原变性牛血清白蛋白
4.3.3 非还原脲变性牛血清白蛋白稀释复性液的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
4.3.4 还原脲变性牛血清白蛋白稀释复性液的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
参考文献
第五章 研究总结与展望
5.1 牛血清白蛋白的变性过程
5.2 变性牛血清白蛋白的复性过程
5.3 展望

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中图分类: > Q591.2 > 生物科学 > 生物化学 > 物质代谢及能量代谢

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