优秀研究生学位论文题录展示

Asp44对肌红蛋白结构与功能影响的研究

专 业: 生物化工
关键词: 肌红蛋白 定点突变 圆二色谱 结构稳定性 紫外可见光谱 过氧化物酶
分类号: Q518.1  O657.7
形 态: 共 72 页 约 47,160 个字 约 2.256 M内容
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内容摘要


蛋白结构的稳定及正确的折叠是它们执行各种生物功能的基础。

蛋白质分子结构与功能的研究一直是生命科学中研究的热点。

长期以来人们认为蛋白表面的氨基酸残基暴露在溶剂中,因而对蛋白结构的稳定性影响甚微。

但最近几年研究成果对这一观念提出了质疑,发现蛋白表面带电氨基酸残基对蛋白的稳定性及性质具有非常大的影响,从而开辟了通过优化蛋白表面电荷与电荷的作用来调节蛋白结构稳定性及功能的新思路。

肌红蛋白是目前人类研究最多的蛋白质之一。

曾有报道发现当将马心肌红蛋白表面44位氨基酸从天冬氨酸突变为赖氨酸后,突变肌红蛋白与细胞色素b5之间的电子转移速率提高了一个数量级,但这一蛋白表面氨基酸对马心肌红蛋白结构稳定性及功能的影响未见报道。

为了进一步了解肌红蛋白Mb表面44位天冬氨酸对肌红蛋白结构和功能的影响,本论文以野生肌红蛋白表达质粒pGYM为模板,设计特异突变引物,通过PCR定点突变的方法将肌红蛋白Mb基因上的第44位酸性氨基酸天冬氨酸D的密码子GAT变成碱性氨基酸赖氨酸K的密码子AAA,获得肌红蛋白突变体D44K的基因。

将带有突变体的目的基因克隆在肌红蛋白表达质粒pGYM上,经热激转化大肠杆菌BL21,大肠杆菌发酵使突变蛋白D44K大量表达、收集菌体。

酶法裂解细菌,依次用硫酸铵沉淀、离子交换柱层析、凝胶柱层析分离纯化突变蛋白,其纯度可达96﹪。

用圆二色谱和紫外可见光谱分别研究野生型肌红蛋白及突变体D44K的耐热、耐酸及盐酸胍诱导的变性过程,实验结果表明:

用碱性氨基酸Lys取代酸性氨基酸Asp44残基,增强了肌红蛋白耐热、耐酸变性能力,导致蛋白质的热变性中点温度Tm由71.9℃提高到75.1℃、酸变性中点pH1/2从3.95降到3.88,但在盐酸胍溶液中,突变体易变性,其变性中点浓度Cm从1.88mM降为1.75mM。

以愈创木酚为底物分别测定了不同条件下MbWT和MbD44K的过氧化物酶活性,实验结果表明:

以愈创木酚为底物时,MbD44K的Km为1.9mM而MbWT的Km为3.3mM。

MbWT和MbD44K过氧化物酶的最适温度均为50℃,在相同温度下,MbD44K的过氧化物酶活性高于MbWT,且其过氧化物酶的热稳定性高于MbWT。

同时实验结果表明:

MbD44K过氧化物酶的最适pH为5.0,且在宽的pH范围内仍保持高过氧化物酶活性,而MbWT过氧化物酶的最适pH5.5,在相同pH下,MbD44K过氧化物酶对酸碱的稳定性高于MbWT,且两者在碱性溶液中其酶活性受到抑制..……

全文目录


摘要
引言
1 文献综述
1.1 概述
1.2 肌红蛋白的结构特征
1.3 肌红蛋白的功能
1.3.1 Mb的储氧功能
1.3.2 Mb的过氧化物酶活性
1.4 肌红蛋白的应用
1.4.1 用肌红蛋白作为过氧化物酶模拟酶的有关应用
1.4.2 肌红蛋白在医学方面的应用
1.5 肌红蛋白Mb结构与功能的研究现状
1.5.1 氨基酸选择突变
1.5.2 血红素化学修饰
1.5.3 氨基酸选择突变和血红素修饰相结合
1.5.4 非天然辅基引入
1.6 PCR定点突变
1.7 圆二色性光谱法
1.8 生物大分子分离纯化方法
1.8.1 凝胶过滤层析GC
1.8.2 离子交换层析IEC
1.8.3 疏水作用层析HIC
1.8.4 金属离子亲和层析IMAC
2 突变体MbD44K的构建
2.1 引言
2.2 实验材料
2.2.1 实验仪器
2.2.2 实验试剂
2.2.3 培养基
2.2.4 引物的设计与合成
2.3 实验方法
2.3.1 质粒提取
2.3.2 PCR定点突变
2.3.3 PCR产物的回收
2.3.4 酶切载体和目的基因
2.3.5 酶切反应物的精制
2.3.6 载体与目的基因的连接
2.3.7 感受态细胞的制备
2.3.7 转化
2.3.8 阳性克隆的筛选
2.3.9 DNA测序
2.4 结果与讨论
2.5 小结
3 突变体MbD44K的表达、分离与纯化
3.1 引言
3.2 实验材料
3.2.1 菌株和质粒
3.2.2 实验仪器
3.2.3 实验试剂及缓冲液
3.3 实验方法
3.3.1 蛋白质的表达
3.3.2 总蛋白溶液的获取
3.3.3 总蛋白的粗提
3.3.4 肌红蛋白的精制
3.4 肌红蛋白浓度的测定
3.5 结果与讨论
3.6 小结
4 肌红蛋白结构稳定性的研究
4.1 引言
4.2 实验材料
4.2.1 实验仪器
4.2.2 实验试剂
4.3 实验方法
4.3.1 热诱导的MbWT和MbD44K去折叠研究
4.3.2 酸性pH介导的MbWT和MbD44K去折叠研究
4.3.3 盐酸胍诱导的MbWT和MbD44K去折叠研究
4.4 结果与讨论
4.4.1 温度对MbWT和MbD44K结构稳定性影响的CD光谱
4.4.2 酸变性对MbWT和MbD44K结构稳定性影响的CD光谱
4.4.3 盐酸胍对MbWT和MbD44K结构稳定性影响的UV-vis光谱
4.5 小结
5 肌红蛋白过氧化物酶活性的研究
5.1 引言
5.2 实验材料
5.2.1 实验仪器
5.2.2 实验试剂
5.3 实验方法
5.3.1 过氧化物酶活性测定的原理
5.3.2 MbWT及MbD44K的过氧化物酶活性的测定
5.3.3 愈创木酚Krn的测定
5.3.4 MbWT及MbD44K过氧化物酶的最适反应温度和热稳定性
5.3.5 MbWT及MbD44K过氧化物酶的最适反应pH值和对pH的稳定性
5.4 结果与讨论
5.4.1 愈创木酚Km的测定
5.4.2 MbWT及MbD44K过氧化物酶的最适反应温度和热稳定性
5.4.3 MbWT及MbD44K过氧化物酶的最适反应pH值和对pH的稳定性
5.5 小结
6.结论与展望
6.1 结论
6.2 创新点
6.3 展望
参考文献
附录A 缩略语表
附录B 肌红蛋白质粒图

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中图分类: > Q518.1 > 生物科学 > 生物化学 > 蛋白质
其他分类: > O657.7 > 数理科学和化学 > 化学 > 分析化学 > 仪器分析法(物理及物理化学分析法)

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