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乙醇胚胎毒性对大鼠听觉系统影响的实验研究

专 业: 耳鼻咽喉科学
关键词: 病理学 神经递质 谷氨酸 γ氨基丁酸 听觉系统 乙醇毒性
分类号: R76
形 态: 共 39 页 约 25,545 个字 约 1.222 M内容
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内容摘要


研究背景

酒精类饮料在世界各地有很大的消耗量和消费人群,慢性乙醇中毒和乙醇依赖已成为常见的医学和社会问题,因此很多学者对乙醇毒性问题进行了多方面的研究。

近来研究发现,乙醇和与其相关的基因相互作用包括和乙醇代谢相关的基因和受乙醇影响受体的基因,改变了乙醇在体内的正常代谢过程和受乙醇影响受体的正常表达,通过多种途径和方式使饮酒者个体及和其子代产生多方面、多器官功能、发育等异常。

妊娠期母体乙醇暴露严重者可导致其子代发生胎儿酒精综合症fetalalcoholsyndrome,FAS,出现畸形、早产、多器官发育不良、神经系统功能障碍等,而目前尚无逆转FAS的治疗办法。

随着各种听觉神经功能的测试方法不断进步、完善,关于乙醇直接毒性和胚胎毒性对听觉系统造成诸多影响的研究也越来越多:

例如对饮酒者测试听性脑干反应auditorybrainstemresponse,ABR,发现ABR各波潜伏期延长,且与其累计乙醇摄入量存在对数关系,这可能是乙醇的直接毒性导致饮酒者脑干损伤使神经冲动传导速度降低而引起听功能异常。

而对胚胎期乙醇暴露的幼鼠测试听觉事件相关电位auditoryevent-relatedpotential,AERP,发现其测出率降低、潜伏期延长、幅值降低,波形不规则,这表明乙醇的胚胎毒性还可导致子代高级听觉功能异常。

既往对乙醇胚胎毒性与听觉系统功能的研究揭示了许多听觉功能异常的现象和规律,但其具体的作用机制尚在进一步探寻中。

正是基于此研究背景,本实验通过建立乙醇胚胎毒性大鼠动物模型,测试其ABR,并结合观察听觉系统发育、病理形态学改变和听觉神经元细胞内神经递质免疫表达情况,探讨乙醇胚胎毒性对大鼠听觉神经系统的影响,探寻乙醇胚胎毒性影响听觉系统的可能作用机制。

本课题为广东省自然科学基金资助项目项目编号:

032853.目的和意义

通过使母鼠在孕期经灌胃注入50%分析纯乙醇,建立胚胎期乙醇暴露大鼠动物模型。

测试不同剂量乙醇暴露下仔鼠ABR,检查听觉神经系统功能情况,观察仔鼠听觉系统发育、病理学和听觉神经元细胞内神经递质谷氨酸Glutamicacid,Glu和γ-氨基丁酸gamma-aminobutyricacid,GABA免疫反应情况,探讨乙醇胚胎毒性对大鼠听觉神经系统的影响及可能作用机制,为预防、治疗相关疾病提供理论基础。

方法

本实验分三个部分。

第一部分:

建立乙醇胚胎毒性大鼠动物模型。

选择健康、耳廓反应灵敏、性发育成熟、有孕育史的雌、雄S-D大鼠按2:1随机配对合笼,通过记录雌鼠体重变化、有无阴道栓、阴道是否扩大、阴道涂片判断其是否交配、受孕成功。

确定交配日期后于交配后第8天通过灌胃途径给予受孕雌鼠50%分析纯乙醇,所产仔鼠即为乙醇胚胎毒性大鼠。

第二部分:

测试ABR。

仔鼠40天龄后选择同天龄正常大鼠作为对照组测试ABR,以同时引出Ⅱ波和Ⅲ波作为判断ABR反应存在的标准,记录Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、到Ⅴ波的潜伏期和波幅,用SPSS10.0统计分析软件将结果进行汇总、统计学处理,分析结果。

第二部分已发表在《临床耳鼻咽喉科杂志》2006年第20卷第7期第319-321页

第三部分:

听觉系统病理变化观察。

完成ABR测试后处死各组大鼠,保留耳廓、外耳道软骨部以便于切片定位,切下颞骨和脑部标本,修剪后置入福尔马林溶液中固定,加入乙烯二胺四醋酸脱钙1个月。

采用平头颅位定位,耳间线中点为嘴尾侧坐标0点,从0点处冠状位切开,分别向前、向后连续行冠状切片,常规HE染色及常规SP法免疫组化检测GABA、Glu表达,光镜下观察外耳、中耳、内耳、螺旋神经节、耳蜗核组织结构及听觉神经元细胞内Glu和GABA免疫组化染色情况。

结果

子代大鼠生存情况:

高剂量组仔鼠共17只,40天龄前夭折6只,测试ABR中麻醉死亡4只。

低剂量组仔鼠共16只,40天龄前夭折3只,测试ABR中麻醉死亡3只。

对照组10只,无夭折、麻醉死亡。

对最后完成ABR测试及病理学观察的例数行R×C表资料x2检验分析结果显示,x2=9.109,v=2,P=0.009,说明各组间差异具有统计学意义。

测试ABR:

对照组Ⅰ波测出率90%,高剂量组和低剂量组Ⅰ波测出率降低分别为14%、30%。

使用R×C表资料x2检验分析结果显示,x2=23.100,v=2,P<0.001,说明各组间差异具有统计学意义。

高剂量组和低剂量组的Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ波潜伏期均长于正常组,以高剂量组的潜伏期为最长。

使用单因素方差分析One-wayANOVA、非平衡设计、LSD多重比较方法的统计分析结果显示高剂量组、低剂量组和正常组Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ波的潜伏期之间差异具有统计学意义P<0.001.高剂量组和低剂量组的Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ波潜伏期之间差异有统计学意义P<0.002.高剂量组和低剂量组的各波幅值均低于正常组,而高剂量组的波幅最低。

经统计学分析,三组Ⅱ波、Ⅲ波波幅方差齐性,高剂量组和对照组Ⅱ波、Ⅲ波波幅差异具有统计学意义Ⅱ波P=0.033,Ⅲ波P=0.004,高剂量组和低剂量组Ⅱ波波幅差异具有统计学意义P=0.036。

三组的Ⅳ波、Ⅴ波波幅方差齐性检验提示其不具有方差齐性,使用TambanesT2多重比较的分析方法结果显示:

高剂量组和对照组Ⅳ波、Ⅴ波波幅差异具有统计学意义均P<0.001.高剂量组和低剂量组Ⅳ波、Ⅴ波波幅差异具有统计学意义分别为P=0.002,P=0.034。

从对照组、低剂量组到高剂量组ABR的Ⅱ波、Ⅲ波、Ⅳ波和Ⅴ波幅值依次降低。

听觉系统病理变化观察:

胚胎期乙醇暴露影响大鼠听觉系统发育,造成神经细胞损伤,神经元内神经递质Glu、GABA含量下降。

听觉感受器主要病理表现为高剂量组和低剂量组大鼠中耳腔内渗液,炎细胞浸润,骨螺旋板疏松,发育不成熟,膜蜗管组织水肿,螺旋器细胞发育不成熟,细胞形态较幼稚,界限不清,排列紊乱,其下间质疏松水肿。

螺旋神经节内细胞发育不一致,大小不均匀,个别细胞有固缩、调亡,部分细胞肿胀,细胞间隙增宽,神经纤维肿胀,排列紊乱。

耳蜗核神经元细胞发育欠佳,神经元细胞突起少,体积小,部分细胞肿胀,周围间隙增大,部分神经元细胞出现单个细胞核固缩,变性坏死。

免疫组化显示螺旋神经节和耳蜗核神经元细胞内Glu、GABA含量下降,对照组听觉神经元内Glu、GABA含量高。

病理变化的程度、范围和乙醇暴露剂量相关:

高剂量组病变程度严重、范围广,神经递质下降幅度大,而低剂量组较轻、范围较小,神经递质下降幅度小。

结论

通过使母体在孕期第8天给予乙醇暴露可成功建立乙醇胚胎毒性大鼠动物模型。

乙醇胚胎毒性对仔鼠听觉神经系统有明显影响。

听觉神经功能异常,表现为冲动传导减慢,ABR波幅值低等,听觉感受器发育不良,听神经细胞损伤,神经元细胞内神经递质Glu、GABA含量减少,其程度与乙醇暴露剂量正相关。

综合分析我们认为乙醇胚胎毒性致大鼠听觉系统发育不良、听神经细胞损伤和神经递质Glu、GABA减少,是导致其听觉功能异常的重要病理基础..……

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前言
材料与方法
结果
讨论
结论
参考文献
附录

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