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洋葱伯克霍尔德氏菌L68菌株邻苯二酚2,3-双加氧酶分离纯化、酶学性质、基因筛选及应用的研究

专 业: 微生物学
关键词: 洋葱伯克霍尔德氏菌 苯酚降解 邻苯二酚2,3-双加氧酶 分离纯化 生物传感器 基因筛选
分类号: Q93
形 态: 共 131 页 约 85,805 个字 约 4.104 M内容
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内容摘要


随着经济的迅猛发展,引发的环境问题倍受关注。

目前我国环境污染严峻,特别是芳香族污染物在土壤和水中的含量急剧上升,严重危及到了人们的生存。

微生物的降解是芳香族污染物脱毒的最有效手段,亦是最终途径。

因此,从环境中筛选高效的芳香族污染物降解菌,研究其降解途径关键酶及其基因的性质与特点,并将其应用到环境问题中去,具有重要的理论意义与实际意义。

本文从环境水体中分离到了多株苯酚降解菌,经过复筛,选择能够高效降解苯酚的L68菌株进行研究。

经形态及生理生化鉴定与。

16S rDNA序列分析,从多相分类的角度并融合细菌系统分类最新研究成果,将L68菌株鉴定为Burkholderiacepacia洋葱伯克霍尔德氏菌、洋葱伯克氏菌、洋葱球茎病伯克氏菌。

对洋葱伯克霍尔德氏菌L68菌株的苯酚降解性能进行了测定,研究结果显示,该菌株适宜生长温度为35℃左右,适宜生长pH值为7.0左右。

在苯酚浓度为0.5g/L的苯酚无机盐液体培养基中35℃、160rpm摇瓶振荡培养L68菌株24h后,用4-氨基安替比啉法不能检测到酚。

当培养基中初始苯酚浓度为0.8g/L时,L68菌株还能够保持一定的对苯酚的降解能力。

L68菌株对苯酚的降解作用主要发生在指数生长期,菌体的生长与苯酚的降解之间呈现正相关。

固定化可以提高L68菌株对苯酚的抗性。

当培养基中初始苯酚浓度高达1.5g/L时,固定化L68菌株仍然可以对苯酚进行降解。

实验证实,洋葱伯克霍尔德氏菌L68菌株只产生邻苯二酚2,3-双加氧酶,通过间位裂解途径使邻苯二酚及其衍生物开环。

本文首次报道了来源于伯克霍尔德氏菌的邻苯二酚2,3-双加氧酶的纯化与一些酶活性质。

通过正交实验优化了该菌株的产酶培养条件,适宜产酶培养条件确定为l‰的苯酚含量,500ml三角瓶中250mi的装液量,0.2%0的酵母粉含量,培养基初始pH值6.0,接种量2.5%。

L68菌株细胞抽提液经硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-150柱层析和DEAE-SepharoseFast Flow柱层析后,经SDS-PAGE检测,达到了电泳纯,提纯倍数为309.66倍,收率为55.43%。

测得该菌株所产邻苯二酚2,3-双加氧酶亚基分子量为34±lkDa,等电点为4.2.邻苯二酚和4-甲基邻苯二酚的Km值分别为4.9μM和9.9μM,是酶的良好底物。

L68菌株邻苯二酚2,3-双加氧酶在紫外光谱吸收上具有普通蛋白的共性。

荧光光谱分析表明,酶显示出很强的荧光,最大发射波长入。

emmax为

336nm,主要表现为色氨酸残基的荧光特征。

在20℃时,圆二色谱测得酶的α-螺旋含量为23.4%,β-折叠含量为45.8%,β-转角含量为15.6%,无规则卷曲含量为15.3%。

pH值对L68菌株邻苯二酚2,3-双加氧酶活性影响较大,该酶的适宜反应pH值为8.0左右,在碱性条件下有较高的稳定性而在酸性条件下不稳定。

酶的适宜反应温度为35℃左右,反应在55℃以上进行时酶活力急剧下降,但是55℃短时间处理对酶活性影响不大,70℃以上的温度处理使酶活力急剧下降,说明该酶具有较好的柔性,该结果得到了园二色谱的印证。

在室温下,该酶的半衰期可达到60天;4℃保存300d时仍具有一定的酶活力;而-20℃的冷冻使酶活力急剧丧失。

与已有报道相比,L68菌株邻苯二酚2,3-双加氧酶适应温度和pH值范围更广。

二价铁离子与镁离子可以显著增加L,68菌株邻苯二酚2,3-双加氧酶的酶活力,强铁离子螯合剂о-邻二氮杂菲与α,α-双吡啶可以降低酶活性,而金属螫合剂EDTA对酶活力的影响不大,说明该酶需要二价铁离子作为辅基,且二价铁离子与酶的结合能力较强。

作为氧化酶,氧化剂H<,2>O<,2>和还原剂抗坏血酸对酶活性的作用比较明显,DTT对于酶活性的影响相对较小。

低浓度的SDS对酶活的影响较小,对酶的荧光猝灭过程属于静态猝灭。

碘化钾可显著降低酶活力与猝灭荧光,属于动态猝灭,说明蛋白质分子表面的色氨酸残基对于酶活力的维持至关重要。

丙烯酰胺的加入对酶活力的影响较小,属于动态猝灭。

盐酸胍对酶活性的影响显著,随着盐酸胍浓度的增加,酶的荧光光谱开始发生显著红移。

本文在国内首次利用细菌生产的邻苯二酚2,3-双加氧酶作为酶源,利用酶反应耗氧的特点将酶反应与氧电极偶联,制备了邻苯二酚2,3-双加氧酶传感器。

反应温度选定为25℃,反应缓冲液pH值选定为7.24。

在选定的工作条件下,邻苯二酚2,3-双加氧酶传感器可以有效的检测水体中的邻苯二酚含量,响应时间短,线性关系良好,有较好的底物特异性。

传感器对邻苯二酚标准液的工作曲线的回归方程为уΔE=-319.85xC-10.202,R<2>值为0.9988。

传感器的工作的线性范围为0.2~3mM,响应时间定为1min,加样回收率为1.03%,纯酶液和粗酶液制备的传感器性能相近。

但是固定化酶膜圈的固定效果不理想,有待改进。

本文采用鸟枪法与邻苯二酚喷洒法相结合的手段,从洋葱伯克霍尔德氏菌L68菌株的总DNA中筛选到了一段长8030bp的含有邻苯二酚2,3-双加氧酶区基因的片段,将携带有该片断的质粒命名为pB2k。

经BLAST比对,该片断含有11个与已报道的ORF相近的ORF。

在该片断的5’端,ORF1和ORF2分别编码两个转移酶基因,tomA1、tomA2、tomA3和tomA4编码酚羟化酶组份,tomA5编码氧化还原酶,phnT编码铁氧还蛋白,phnE编码邻苯二酚2,3-双加氧酶,ORF3编码未知功能蛋白,phnG编码部分2-羟粘糠酸半醛脱氢酶。

该片断序列已提交GenBank收录,收录号为DQl91058。

对该片断的分析首次报道了在伯克霍尔德氏菌属中,苯酚降解相关基因成簇排列的现象。

在一级、二级和三级结构上对相关基因编码蛋白进行了生物信息学分析与预测。

本文利用pET 32a表达载体,成功构建了邻苯二酚2,3-双加氧酶表达载体,在表达菌株中实现了重组邻苯二酚2,3-双加氧酶的高效表达。

但是,经诱导后发现绝大多数重组邻苯二酚2,3-双加氧酶蛋白以包涵体的形式存在于沉淀中。

对重组邻苯二酚2,3-双加氧酶蛋白包涵体进行了洗涤、变性、金属螯和层析纯化与梯度透析复性。

经SDS-PAGE分析,复性后的重组蛋白纯度达到了98.44%,回收率达到4。

09%,复性率为4.94%。

本文选用PhnE基因作为指示基因,应用竞争性定量PCR技术检测并定量环境样品中的I.2.C亚类的邻苯二酚2,3-双加氧酶基因,该技术在研究生物修复土壤的生态学中有着重要的应用价值。

利用连入T载体的phnE基因内部序列反向设计引物,PCR反应后产物自连,成功构建了竞争性质粒DNA。

在本文选定的条件下,扩增循环数与非扩增性DNA对竞争性定量PCR的准确性的影响不大,phnE基因拷贝数的定量仅取决于目的DNA和竞争性DNA的比例。

在三个待测土壤样品中,检测到样品sl和s3每克土壤中分别含6.2x10’和5.8x10<;7>个phnE基因拷贝数,而样品S2中没有检到phnE基因,则可能与高的底物浓度有关。

竞争性定量PCR产物的序列测定与活性测定表明扩增出的确实是邻苯二酚2,3-双加氧酶基因phnE..……

全文目录


摘要
英文摘要
论文缩写词表
第一章 绪论
第二章 苯酚降解菌L68的分离鉴定及苯酚降解性能测定
第三章 邻苯二酚2,3-双加氧酶的分离纯化及性质研究
第四章 邻苯二酚2,3-双加氧酶生物传感器
第五章 Burkholderia cepacia L68双加氧酶区基因筛选
第六章 phnE基因的克隆、高效表达、包涵体纯化及复性
第七章 石油污染土壤中phnE基因的竞争性PCR检测与定量
参考文献

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中图分类: > Q93 > 生物科学 > 微生物学

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