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大白菜和甜瓜中K〈+〉通道基因的克隆及其功能表达分析研究

专 业: 生物化学与分子生物学
关键词: 大白菜 甜瓜 基因克隆 表达模式 钾元素
分类号: S601
形 态: 共 132 页 约 86,460 个字 约 4.136 M内容
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内容摘要


钾是植物中的一种主要的营养元素,是植物细胞中含量最多的一种阳子,在有的种类中占植物干重高达10%,在许多生理功能方面起着重要用,而且对作物品质起着重要作用,被认为是品质元素。

因此,植物在生长过程中需要大量的钾,由于土壤中供钾较少,钾对作物产量来说通常是一种限制元素,全球每年需要钾肥约2000万吨。

研究植物中钾离子的吸收转运情况及钾离子的有效利用显得尤其重要,K<’+>通道是植物吸收转运大量钾的主要方式,研究K<’+>通道的分子生物学对了解这一过程有着重要的作用。

大白菜Brassica rapa ssp.Pekinensis与模式植物拟南芥同科,是我重要的一种蔬菜。

本研究利用RACE-PCR方法首先在的大白菜叶片中隆了一个钾离子通道基因KCT2K<’+> channel in Cabbage for Transporting,CenBank accession number:

AY796219,并利用生物信息学手段对其主要结构特征和功能特征进行了分析。

这个基因全长2264 bp,编码一个685个氨基酸残基的多肽。

这个推测的多肽包含5个跨膜片段,一个xxTxGYGD motif在最后两个跨膜片段之间。

多肽还含有一个亲水的长的 C-末端。

进化树分析表明,KCT2与拟南芥Arabidopsis中的钾离子通道相比较,与KAT2最相近。

利用DNA杂交试验表明,KCT2在大白荚基因组里可能是不同形式表达的单拷贝基因或属于一个有4-5个相近基因的一个基因家族。

钾离子通道在植物的许多生理过程中起着重要作用,其中之一就是调节植物体对逆境的适应。

我们利用半定量RT-PCR研究了KCT2的组织表达特异性和不同逆境条件下的表达模式。

KCT2在叶中的表达水平比在茎中和根中要强,主要是在叶中表达。

在ABA处理4小时、4℃冷害处理24小时、干旱处理1小时和氯化钠盐处理12小时后,KCT2的转录量相比对照升高。

在水淹8小时即缺氧处理时,KCT2的表达量没有明显改变,而在4℃冷害处理48小时后,KCT2的转录量下降。

KCT2的表达分析显示在植物适应逆境早期,KCT2的表达量增大,促使钾离子的转运。

结果显示这个K<+>通道在植物适应逆境方面起着重要作用。

KCT2是第一个从芸苔属里克隆到的K<+>通道基因。

在不同逆境条件下表达模式分析表明KCT2可能在植物遭遇逆境早期对促使K<+>转运起一定作用。

甜瓜Cμcumis melo L.是世界十大果品之一,是我国重要的一种设施栽培作物。

成功地从大白菜中克隆出一个K<+>道基因后,我们又利用RACE-PCR方法在甜瓜叶片中克隆了一个钾离子通道基因MIRKMelonInward Rectifying K<+>channel,GenBank accession number:

DQl 16940,并利用生物信息学手段对其主要结构特征和功能特征进行了分析。

这个基因全长2506 bp,编码一个701个氨基酸残基的多肽。

这个推测的多肽包含6个跨膜片段,一个TXxTxGYGD motif在最后两个跨膜片段之间。

多肽还含有一个亲水的长的C-末端,有一个环核苷酸结合位点在这一区域。

进化树分析表明,MIRK与拟南芥Arabidopsis中的钾离子通道相比较,与KATl最相近。

为了验证MIRK是否具有转运K<+>的功能,我们利用酵母表达载体pYES2.1

V5-His-TOPO ,将MIRK的完整编码区转化到一个钾离子吸收缺陷性酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae突变株EBG202中。

通过不同质粒转化酵母的比较试验,结果表明EBG202转化空的pYES2.1

V5.ms-TOPO 载体后,可以在含100mM钾离子浓度SC-U的培养基上生长,但却不能在含2 mM钾离子浓度SC-U的培养基上生长。

将MIRK转化至EBG202,菌株可以在含有2mm钾离子浓度SC-U的培养基上生长。

这些结果显示,MIRK编码的蛋白可以在酵母中起到钾离子运输的作用,验证了MIRK是编码甜瓜中一个钾离子通道的基因。

为了了解甜瓜叶片中钾和氮相互作用及有关基因在不同条件下的表达情况。

我们利用RACE-PCR方法在甜瓜Cucumis meloL.叶片中克隆了一个谷氨酰胺合成酶基因M-GS2GenBank accession number AY773090,并利用生物信息学手段对其主要结构特征和功能特征进行了分析。

这个基因全长1807bp,编码一个432个氨基酸残基的多肽。

经生物信息学分析这个多肽是谷氨酰胺合成酶的前体,在这个多肽的N-端有一个53个氨基酸残基的穿越肽段,这个多肽定位于叶绿体内。

序列和结构分析显示m-GS2编码的这个蛋白包含了一个GS beta-GrasP功能区和GS催化功能区,这些功能区在植物的谷氨酰胺合成酶中是保守的。

进化树分析表明m-GS2和黑核桃Juglans nigraGS2最相近。

试验以半量Hoagland营养液为基本栽培营养液,通过对甜瓜进行不同处理,利用半定量RT-PCR分析了MIRK在不同栽培条件下的表达模式及其和M-GS2的表达分析比较。

MIRK主要在甜瓜叶部和初期发育的果实中表达,在茎和花中也有表达,在根中基本不表达。

MIRK在不同浓度硝态氮源处理8小时时,在7.5mM时表达量最高,处理1天时,在0.75mM时表达量最高,处理3天时,在7.5mM时表达量最高。

MIRK在不同浓度氨态氮处理8小时时,在0.75mM时表达量最高,处理1天时,在3.75mM时表达量最高,处理3天时,表达量基本相同。

MIRK在不同钾离子浓度处理4小时、1天和3天时,无钾处理时的表达量最高;在处理8天时,12mM浓度处理时的表达量最高。

MIRK在不同浓度NaCl处理时,均为400mM时的表达量最高。

在甜瓜果实不同的发育阶段,MIRK在开始发育阶段时的表达量最高,而后急剧下降。

说明MIRK可能在甜瓜果实发育过程中起着一个重要作用。

在不同浓度硝态氮处理下,GS2和MIRK在处理8小时和3天时,都是在7.5mM浓度时表达量最大,在处理1天时,各浓度间差异均不大。

在不同浓度氨态氮处理下,8小时时,MIRK在0.75mM时表达量最大,而GS2表达量差异不大;处理1天时,GS2在7.5mM浓度时表达量最大,而MIRK的表达差异不大;处理3天时,两个基因的表达在不同浓度间差异不大。

在不同钾离子浓度处理时,4小时时,GS2在12mM时表达量较高,而MIRK则在无钾时表达较高,但绝对值较低;处理1天时,GS2的表达量在各浓度间变化不大,MIRK表达和在4小时处理时一样;处理3天时,MIRK在无钾和12mM时表达量较高,GS2则变化不大,但其表达的绝对值要大的多;处理8天时,MIRK要12mM时表达量最高,GS2的表达则没有大的差异。

在不同浓度的NaCl溶液处理时,在24小时时,MIRK和GS2的表达量没有太大差异,MIRK在400mM时表达量稍高;在48小时时,GS2的表达量随处理浓度的增加而减少,而MIRK则随处理浓度的增加而增大。

在甜瓜果实不同发育阶段,MIRK在初期表达量最大,随后表达量急剧下降,而GS2则在3-4周时表达量较大。

通过对MIRK及GS2在不同甜瓜栽培条件下的表达分析,可以初步说明MIRK和M-GS2在甜瓜的生长发育中起着较为重要的作用..……

全文目录


文摘
英文文摘
主要英文缩写表
第一部分 绪言
第三部分 MIRK和KCT2的功能验证及表达分析
总结与展望

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中图分类: > S601 > 农业科学 > 园艺 > 一般性问题 > 生物学原理

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