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产纤维素酶真菌的基因组重组初探

专 业: 微生物学
关键词: 原生质体融合 基因组重排 斜卧青霉 SDS-PAGE蛋白图谱
分类号: Q93
形 态: 共 69 页 约 45,195 个字 约 2.162 M内容
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内容摘要


纤维素是自然界中存在最广泛的一类碳水化合物,同时它也是地球上数量最大的再生资源。

纤维素酶cellulase能将天然纤维素降解生成纤维素分子链、纤维二糖和葡萄糖。

利用微生物生产的纤维素酶将其转化为人类急需的能源、食物和化工原料,对于人类社会解决环境污染、食物短缺和能源危机具有重大的现实意义。

分子育种技术molecular breeding继承和发展了杂交育种,引进了新的概念和方法,可以加速育种进度。

本文采用基因组重排genomeshuffling进行分子育种,对象是整个细胞,能弥补诱变育种的不足。

把通过诱变育种改良获得的多种不同的突变株进行多次连续的原生质体融合,使得不同菌株来源的基因组能够得到充分的重组,高通量检出得到一批性能改善的重组子,再进入下一轮的基因组重排,可大大提高重组率。



本课题以纤维素酶生产菌株斜卧青霉Penicillium decumbens为出发菌株,通过原生质体的制备、原生质体反复融合,使细胞进行基因组重排,得到一系列与亲本相比具有优越性的重组子。

将这些重组子和亲本菌株进行了形态学,产酶活力以及胞外全蛋白电泳图谱分析比较,证实了重组子和亲本的亲缘关系,以及融合过程中的染色体发生的交换分离。

首先以青霉菌株M114和Ju-A10为例,研究了青霉的菌丝及孢子原生质体的形成和再生条件。

菌丝制备原生质体的条件为3 mg/mL纤维素酶和3 mg/mL蜗牛酶对生长32 h的菌丝体进行处理,处理时间为1 h。

对于耐受性孢子,加大酶的用量为5 mg/mL,孢子预先萌发8 h,酶处理12 h~18 h,原生质体产率可达85%。

原生质体的再生采用葡萄糖再生培养基效果最好,再生率可达81%。

在PEG的诱导下进行了M114和Ju-A10的原生质体融合,得到融合子Fu-3.表型上它分别具有两亲本的特征性状,菌丝形态如M114,分生孢子如Ju-A10:

其CMCase酶活可以达到M114的2.38倍,Ju-A10的l.86倍;胞外全蛋白SDS-PAGE电泳分析结果表明主要蛋白条带类似M114,但是分泌量上要多于M114。

在此基础上研究了多亲本回归反复的融合基因组重排,采用的菌株为斜卧青霉114-2以及其突变株Ju-A10及1541.将融合后的菌株不经筛选就进行下一轮融合,经过这样反复多次的操作才进行筛选,使得不同菌株来源的基因组能够得到充分的重组,不同正向突变整合到同一重组子中的机会增加,从而使得再生菌落的基因组重组程度大幅度提高50-10<5>倍。

通过原生质体融合得到了一系列的重组子,其CMCase酶活均高于亲本中酶活最高的菌株Ju-A10。

其中Fu-35菌株产酶明显要早,产酶效率有很大的提高。

72h时的容积生产率达到了189 IU/h·L,比原出发株中最优秀的Ju-A10的108 IU/h·L高出了75%。

Fu-27的最高酶活也可达Ju-A10的1.25倍。

形态学分析和胞外全蛋白SDS-PAGE电泳分析认为重组子无论在形态上还是蛋白图谱上都表现出了与亲本的亲缘关系,同时也存在与亲本的差异..……

全文目录


摘 要
英文摘要
第一章 概述
第二章 青霉M114及Ju-A10的原生质体制备与再生
第三章 基于原生质体融合的基因组重排及融合子的形态学观察
第四章 重组子与亲本产酶性质的比较
参考文献

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