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一株产转糖基β-半乳糖苷酶的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的筛选、鉴定及酶学性质研究

专 业: 微生物学
关键词: 巨大芽孢杆菌 β-半乳糖苷酶 转糖基作用 低聚半乳糖 纯化 酶学性质
分类号: Q93
形 态: 共 58 页 约 37,990 个字 约 1.817 M内容
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内容摘要


低聚糖具有显著的生理功能,已成为近年糖生物学的研究热点。

低聚糖通常是由2~10个单糖通过糖苷链连接形成的直链或支链的一类低度聚合糖,作为其中的一种低聚半乳糖是在乳糖分子的半乳糖基一侧连接上1~4个半乳糖基生成的低聚糖类。

目前,世界上低聚半乳糖的工业产品主要是利用生物技术,用β-半乳糖苷酶的水解活性和转糖基活性以乳糖来进行生产。

迄今为止,很多不同微生物来源的β-半乳糖苷酶已被分离并且用于低聚半乳糖的生产.由于酶的来源不同,其水解活性和转糖基活性相对比例、产物中低聚半乳糖的所占比例以及产物结构也有很大不同。

本文通过水解活性和转糖基活性筛选,从实验室97株保存菌种中获得一株具有转糖基活性的β-半乳糖苷酶产生菌,克隆并序列分析了该菌株16S rDNA基因片断,GenBank收录号为DQ267829.综合其形态学特征、生理生化特征及16S rDNA序列同源性分析结果,将其鉴定为巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium2-37-4-1.确定了该菌株β-半乳糖苷酶产酶培养基的碳源为乳糖l%,氮源为蛋白胨0.5%和酵母膏0.5%.培养条件为37℃摇床培养18h;碳源实验证明,该菌株β-半乳糖苷酶产生为乳糖诱导型.利用薄层层析技术研究了pH值、乳糖底物浓度、反应温度和反应时间对该菌株β-半乳糖苷酶以乳糖为底物转糖基合成低聚半乳糖的影响,确定最适反应条件为pH7.5、50mmol/L磷酸缓冲液配制的30%乳糖溶液,55℃反应24h转糖基反应产物高压液相色谱分析其组成为低聚半乳糖25.68%、双糖包括乳糖和转移二糖33.02%、葡萄糖26.37%和半乳糖14.92%。

进一步对巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium2-37-4-1产生的转糖基β-半乳糖苷酶进行了纯化和酶学性质研究.细胞采用超声波破碎得无细胞提取液,然后经过硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow柱层析、Gigapite K-100S柱层析及APTG亲和层析,酶蛋白在SDS-PAGE中银染为一条带,分子量为125.9kD,获得电泳纯的β-半乳糖苷酶,酶的比活力提高了10.2倍,活力回收率为7.1%,纯化后的酶蛋白的Nativegradient PAGE结果显示该酶的活性自然状态是一个分子量为126.5kD的单亚基蛋白.酶的性质研究表明,该酶的最适反应温度为55℃-20℃保存具有较好的低温稳定性:

最适反应pH为7.5,酶在pH6.0~9.0之间比较稳定.在55℃以乳糖为底物进行反应的Km=16.2mmol/L,Vmax=54.05μmol/L.min;该酶对β-D-半乳糖苷键具有高度的专一性,与糖苷键相连的配基对酶活也有很大影响;该酶转糖基反应具有广泛的糖基受体,可利用多种糖类为受体进行转糖基反应。

以上工作为进一步对Bacillus megaterium 2-37-4-1β-半乳糖苷酶的基因克隆、基因突变和基因改造以获得高效转糖基活性的β-半乳糖苷酶奠定了基础..……

全文目录


符号与缩写
摘要
英文摘要
1前言
2转糖基β-半乳糖苷酶产生菌的筛选和鉴定及酶的转糖基作用合成低聚半乳糖研究
3巨大芽孢杆菌转糖基β-半乳糖苷酶的纯化及酶学性质
附录
参考文献

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