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火菇素cDNA基因的原核表达与重组蛋白的纯化及活性研究

专 业: 微生物学
关键词: 火菇素 cDNA基因 原核表达 重组蛋白 包涵体复性 U937细胞株
分类号: Q93
形 态: 共 60 页 约 39,300 个字 约 1.88 M内容
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内容摘要


火菇素是一种具有抗癌活性的典型的食用菌蛋白类药物,由日本人KomatsuN.等1963首先从金针菇中分离出来。

火菇素对小鼠肉瘤S180和艾氏腹水瘤有明显的抑制作用,且能延长小鼠的生存期。

在火菇素的作用下,肿瘤细胞发生了明显的病理变化:

细胞的有丝分裂受到抑制,细胞核、细胞质中形成空泡,使细胞膨胀破裂,最终导致细胞溶解。

毒性实验研究表明,火菇素对生物机体无明显的毒副作用。

本论文的主要工作在于火菇素cDNA基因的原核表达,重组蛋白的纯化及活性的研究。

由于常规提取火菇素工作量大、周期长、得率低,故而阻碍了其进一步的开发与应用。

利用大肠杆菌高效表达火菇素蛋白能很好的解决了进一步在动物实验和临床药理实验研究的原料问题。

而检测基因工程菌表达的蛋白同样具有抑瘤活性是进一步证明可替代常规提取的火菇素。

将火菇素cDNA基因序列扩增,用双酶切法将其插入到原核表达质粒pET32a+上,然后转化到大肠杆菌BL2lDE3中,筛选阳性克隆,进行质粒双酶切、DNA测序等鉴定,用10%的甘油保存在-20℃冰箱中。

用终浓度为1mmol/L的IPTG在30℃诱导表达蛋白。

通过聚丙烯酰胺变性凝胶电泳发现在分子量约为38 000Da处有一新生蛋白质条带,即火菇素重组蛋白。

实验表明重组蛋白以可溶和不可溶两种形式存在于大肠杆菌中。

将大肠杆菌进行超声波细胞破碎,离心,分别收集上清液和包涵体。

将上清液穿过Ni<+>NTA his bind resin,通过组氨酸和金属镍的特异亲和特性,将目的蛋白挂在柱上,增加缓冲液中的咪唑浓度再洗脱目的蛋白,达到纯化的目的。

用West blot实验证明重组蛋白能与天然火菇素制备的家兔血清免疫结合。

将包涵体用低浓度的尿素洗涤,然后用高浓度的尿素完全溶解之,再次高速离心,将上清液穿过Ni<+>-NTA his bind resin,通过改变层析柱的pH值达到分离纯化变性蛋白的目的。

收集的洗脱峰采用尿素浓度梯度透析复性。

将火菇素重组蛋白作用于人急性单核细胞性白血病细胞株U937,用倒置显微镜、普通光学显微镜、激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测重组蛋白作用下的肿瘤细胞的形态特征和细胞周期。

通过将终浓度20μg/ml的火菇素重组蛋白加入到U937细胞培养液中,作用24h后,收集细胞、洗涤、70%乙醇固定、PI姬姆萨染色、镜检,上流式细胞仪分析。

结果表明,用倒置相差显微镜、普通光学显微镜以及激光共聚焦显微镜观察,均能观察到凋亡细胞的特征,给药组与对照组有很大的区别。

结果说明火菇素重组蛋白能够促进U937肿瘤细胞的凋亡,和天然火菇素一样有抗癌抑瘤效果,可作为今后的火菇素研发提供蛋白来源的新途径..……

全文目录


摘要
英文摘要
缩略词表
1绪论
2火菇素cDNA基因的原核载体表达与重组蛋白的纯化
3火菇素重组包涵体蛋白的复性研究
4火菇素抑瘤活性的研究
参考文献

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