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一株假单胞菌尼古丁降解相关酶的初步研究

专 业: 微生物学
关键词: 假单胞菌 尼古丁降解 6-羟基-3-琥珀酰吡啶氧化酶
分类号: Q93
形 态: 共 67 页 约 43,885 个字 约 2.099 M内容
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内容摘要


烟草中的主要生物碱尼古丁,是一种精神药品,由于人类长期的吸食习惯,导致了对烟草中尼古丁的依赖,同时吸烟和烟气环境严重威胁人类的健康;烟草加工过程产生了含高浓度的尼古丁的废物,这些都属于有毒的污染物,因此有效地控制卷烟和环境中的尼古丁的含量,对于维护人类健康有着深远的意义。

由于某些微生物具有降低烟草中尼古丁含量的作用,有关微生物代谢尼古丁的研究逐渐引起了微生物学者和烟草研究人员的关注。

但有关这方面的研究主要集中在细菌的两个属:

假单胞菌属和节杆菌属。

其中,对氧化节杆菌Arthrobactel oxidans作了较系统的研究,阐明了它的代谢途径,涉及到的酶及基因序列己基本清楚;但对于假单胞菌属Pseudomonas sp.细菌,只初步分析了代谢途径,相关的酶学证据、酶和基因方面的研究还没有进行。

本实验室经过前期的工作获得一株可以降解尼古丁的假单胞菌株S16,并纯化了代谢途径中的两种中间产物3-琥珀酰吡啶 3-Succinoyl pyridine,SP和6-羟基-3-琥珀酰吡啶6-Hvdroxy-3-succinoylpyridine,HSP。

本论文的工作中,以该假单胞菌株和上述的2种中间产物为研究对象,对粗酶液作用下的这两种化合物的反应开展初步研究。

以假单胞菌S16的粗酶液为催化剂,SP和HSP依次为底物,检测生成的产物,进一步确定反应时底物SP和产物HSP,底物HSP和产物2,5-二羟基吡啶2,5-DihydroxypyTidine,DHP之间量的关系,结果证明SP在S16粗酶液作用下生成HSP,而HSP继续反应生成DHP和琥珀酸,进一步从酶学角度验证了代谢途径中的这两步反应。

为获得更多的细胞催化剂,优化S16的基础培养基,选择不同的碳氮源,并通过综合考虑休止细胞对尼古丁的降解活性和获得的细胞量来确定外加碳氮源的种类和比例,经过优化确定以葡萄糖为碳源,浓度1%,硫酸铵为氮源,浓度0.4%,尼古丁浓度为lmg/ml,在生长12h后其OD<,620nm>。

可达到7.0左右,细胞的活性与未添加葡萄糖和硫酸铵的培养基培养得到的细胞基本一致。

在该优化条件下,设计实验验证SP、HsP和DHP对假单胞菌S16的酶系的诱导作用,结果没有加入诱导物的粗酶液对这几种化合物都没有活性,加入诱导物后粗酶液出现了对这三种中间物的降解能力,但不能降解尼古丁。

由于尼古丁、SP、HSP和DHP在结构上的相似性,不能直接通过分光光度计法测定。

首先建立了的各自的检测方法,在此基础上,优化各反应条件,如pH、温度、反应所需的辅因子等,在对各酶进行了初步的条件摸索后,选择其中的HSP的降解的酶进行研究,根据该反应中底物和产物的性质,定名该酶为6-羟基-3-琥珀酰吡啶氧化酶,经过实验确定该酶反应的最适pH为8.0,最适温度为20℃,底物浓度为0.4 m/ml时,反应速度最快,该酶的性质研究及纯化工作正在进行中..……

全文目录


文摘
英文文摘
第一章 前言
第二章 S16的粗酶液体系对尼古丁代谢途径的验证
第三章 S16尼古丁代谢相关酶的诱导
第四章 S16尼古丁代谢相关酶的粗酶液反应过程的条件优化
参考文献

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