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hBMP-7的定点突变及其在甲醇酵母中的表达鉴定

专 业: 动物学
关键词: 人骨形态发生蛋白-7 毕赤酵母 定点突变 异位诱导成骨
分类号: Q418  Q591
形 态: 共 76 页 约 49,780 个字 约 2.381 M内容
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内容摘要


骨形态发生蛋白Bone Morphogenesis Proteins,BMPs是一类蛋白质生长因子,在动物包括人类的生长发育过程中对组织器官的决定与分化起重要作用。

骨形态发生蛋白-7BMP7又称成骨蛋白-1Osteogenic Protein-1,OP-1具有促使细胞组织分化形成骨组织的作用。

该研究尝试建立hBMP7成熟片段在毕赤酵母Pichiapastoris中的表达技术。

主要研究工作包括:

将hBMP7全长cDNA的成熟片段克隆到分泌型表达载体质粒pPIC9K多克隆位点上,构建能表达hBMP7成熟肽的载体质粒;以这一表达载体为基础,依据酵母密码子使用偏好性,将hBMP7成熟片段内3个酵母使用频率为O的精氨酸密码子突变为使用频率较高的同义密码子AGA,以期实现高效表达;表达质粒经转化酵母宿主菌株KM71,PCR鉴定基因整合后,摇瓶培养,甲醇诱导表达并用点杂交快速筛选高表达菌株。

摇瓶表达上清经Tricine-PAGE分析表明在18KD处有一新增条带;Western-Blotting表明该条带具有良好的抗原性和特异性,证实为hBMP7,重组产物的理论分子量为15。

6KD,实际值为18KD,推测产物带有一定程度的糖基化修饰,重组产物以单体形式存在,没有检测到预期的二聚体形式。

利用蛋白质Bradford总蛋白定量,结合Glyko BandScan量化软件的分析发现,表达上清中特异性蛋白的表达量可达到25。

45μg/ml,占总蛋白含量的76.2%;密码子优化使rhBMP7摇瓶培养表达量较未优化序列提高了4~5倍;对不同诱导条件的观察表明:

诱导5d表达量达到最高水平;保持以终浓度为1的甲醇进行诱导得到最高表达量;调整诱导前菌体生物量在10左右,蛋白的表达量最为理想。

通过经典的小鼠股部肌袋包埋实验,初步证明毕赤酵母分泌表达的rhBMP7成熟片段能够诱导间充质干细胞MSC分化为软骨细胞……

全文目录


前言
文献回顾
1 BMPs的研究概况
2 毕赤酵母真核表达系统的优化策略
本实验的研究目的和意义
实验内容
1 hBMP7 毕赤酵母表达载体的构建及成熟片断的定点突变
2 hBMP7成熟片段在毕赤酵母中的表达及鉴定
3 rhBMP7生物活性的初步研究
结论
参考文献
中文摘要
附录
1 重组质粒pPic9K/hBMP7/mut测序图

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中图分类: > Q418 > 生物科学 > 生理学 > 普通生理学 > 生长、发育与生殖
其他分类: > Q591 > 生物科学 > 生物化学 > 物质代谢及能量代谢

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