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人骨形成蛋白-4和人骨形成蛋白-7在毕赤酵母中的共表达及其纯化

专 业: 动物学
关键词: hBMP4 hBMP7 毕赤酵母 共表达 纯化
分类号: Q418  Q591
形 态: 共 78 页 约 51,090 个字 约 2.444 M内容
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内容摘要


骨形成蛋白bone morphogenetic proteins,BMPs,通常也称之为骨形态发生蛋白或骨生成素,是一类广谱性的生长调节因子.已有的研究表明,BMPs的功能不仅仅局限于能诱导未分化的间充质细胞不可逆地转化为软骨和骨,BMPs还对组织器官的胚胎发生和形态形成起重要作用.另外,BMPs还参与调节包括间充质细胞、上皮细胞、造血细胞和神经细胞在内的多种细胞的增殖、分化、趋化性和调亡.有研究表明,不同种BMP实现共表达后,活性比单种表达时有显著的提高,如人骨形成蛋白-4hBMP4与人骨形成蛋白-7hBMP7在CHO细胞实现共表达后,活性比人骨形成蛋白-4单种表达时提高5倍另有研究表明,BMP异源二聚体的生理效应要比同源二聚体高10~20倍之多.因此,该研究尝试利用hBMP4和hBMP7的成熟肽cDNA片段制备转基因酵母菌株,从而对hBMP4与hBMP7在毕赤酵母细胞共表达的实现和hBMP4/7异源二聚体的形成进行探讨.该论文的主要工作包括hBMP4与hBMP7在毕赤酵母细胞中共表达技术的建立;hBMP4与hBMP7的发酵工艺;蛋白纯化工艺;抗原反应活性及理化性质的研究.摇瓶培养确定最适培养基为BMGY/BMMY;培养基的最适pH值为6.0;最佳甲醇诱导浓度为1%;最适诱导周期为96小时.经斑点印迹和蛋白质印迹证实了表达产物含有hBMP4与hBMP7,均具有良好的抗原性和特异性.经还原性和非还原性SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结合蛋白质印迹鉴定,所获得的hBMP4与hBMP7为单体蛋白,分子量分别为26KD和17KD.利用Bradford蛋白质定量法并结合Glyko BandScan量化软件的分析发现,表达上清中hBMP4表达量达到33.34mg/L,占总蛋白含量的50.4,hBMP7的表达量达到13.76mg/L,占总蛋白含量的20.8.用阳离子交换层析法结合疏水柱层析法进行纯化,最终纯化得到的目的蛋白纯度达到80以上……

全文目录


内容提要
英文文摘
序言
第一部分 文献综述
1 基因工程制药的研究概况
2 骨形态发生蛋白的研究与应用
2.1 BMPs及其受体
2.2 BMPs的生物学特性
2.3 BMPs在临床应用中的研究
3 毕赤酵母真核表达系统
3.1 几种不同表达体系和毕赤酵母表达系统的特性及比较
3.2 毕赤酵母表达系统的特点
3.3 影响外源蛋白在毕赤酵母中表达的因素
第二部分 材料与方法
1 材料
1.1 菌株和载体
1.2 工具酶
1.3 其它试剂
1.4 常用培养基和缓冲液
1.5 寡聚核甘酸引物
1.6 主要仪器
2 实验方法
2.1 表达质粒的制备
2.2 重组质粒转化酵母感受态细胞
2.3 重组酵母的筛选
2.4 重组酵母细胞的诱导表达
2.5 表达产物的鉴定
2.6 发酵条件的优化
2.7 表达产物的分离纯化
2.8 纯化产物的处理
2.9 表达产物的定量分析
2.10 纯化蛋白的理化性质检测
第三部分 结果与分析
1 表达质粒的制备
2 酵母转化子筛选及鉴定
2.1 酵母转化子的筛选工作汇总
2.2 PCR筛选及鉴定
2.3 SDS-PAGE鉴定
2.4 Dot-Blotting鉴定
3 发酵条件的优化
3.1 不同初始pH值的培养基对蛋白表达的影响
3.2 初始诱导时的菌体密度诱导OD对蛋白表达的影响
3.3 甲醇诱导时间对蛋白表达的影响
3.4 甲醇诱导浓度对蛋白表达的影响
4 表达产物的柱层析法纯化
5 纯化产物的鉴定
5.1 SDS-PAGE鉴定
5.2 Western Blotting鉴定
6 表达产物的定量分析
7 纯化产物rhBMP4和rhBMP7的表观特征与溶解性
第四部分 小结与讨论
1 菌株表型
2 外源基因
3 转化效率
4 培养基
5 pH值
6 菌体密度
7 甲醇浓度
8 表达量
9 糖基化
英文缩略词表
参考文献
中文摘要

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中图分类: > Q418 > 生物科学 > 生理学 > 普通生理学 > 生长、发育与生殖
其他分类: > Q591 > 生物科学 > 生物化学 > 物质代谢及能量代谢

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