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发酵法产邻苯二酚菌株的筛选及固定化细胞的条件优化

专 业: 微生物学
关键词: 邻苯二酚 菌株筛选 细胞固定条件 双加氧酶
分类号: Q93
形 态: 共 60 页 约 39,300 个字 约 1.88 M内容
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内容摘要


本文从土壤中筛选到以苯甲酸钠为唯一碳源的产生邻苯二酚的菌株44株,其中以X16菌株产生邻苯二酚的能力最强。

经形态特征及16S rDNA序列同源性比较,初步鉴定×16为假单胞菌PSeudomonasp sp.。

经培养条件的初步优化,发酵液中邻苯二酚的含量达到1.0mg/mL;同时以海藻酸钠、明胶、聚乙烯醇以及海藻酸钠和聚乙烯醇的混合物对X16菌株进行细胞固定化研究,通过单一材料细胞固定和混合材料细胞固定的条件的初步优化,并对其固定效果的比较,发现海藻酸钠和聚乙烯醇混合的固定效果最好,发酵液中邻苯二酚的含量达到1.4mg/mL。

提取X16的粗酶液进行检测其邻苯二酚1,2-双加氧酶和邻苯二酚2,3-双加氧酶降解邻苯二酚的活性,分别从pH、温度、金属离子及作用时间等方面对邻苯二酚1,2-双加氧酶和邻苯二酚2,3-双加氧酶进行初步研究,对今后研究邻苯二酚1,2-双加氧酶和邻苯二酚2,3-双加氧酶打下基础..……

全文目录


文摘
英文文摘
第一章 前言
1.1邻苯二酚的理化性质
1.2邻苯二酚的生产现状及市场
1.3邻苯二酚的生产方法
1.3.1化学工艺法生产邻苯二酚
1.3.2生物发酵法合成邻苯二酚
1.4邻苯二酚纯化
1.5本研究的实验技术路线
第二章 材料与方法
2.1材料
2.1.1土壤样品来源
2.1.2菌株和质粒
2.2培养基
2.3菌种保存
2.4生长条件
2.5溶液、缓冲液和试剂
2.6常用抗生素及其使用浓度
2.7仪器
2.8 DNA的提取
2.8.1质粒DNA的制备
2.9邻苯二酚产生菌总DNA的提取
2.9.1常规提取
2.9.2快速提取
2.9.3邻苯二酚产生菌总DNA的大量提取
2.10质粒DNA的纯化、定量与沉淀
2.10.1酚/氯仿抽提
2.10.2质粒DNA的沉淀与贮存
2.11 DNA酶切
2.11.1 DNA的限制性内切酶酶切
2.11.2酶切DNA片段的CIP处理
2.12 DNA酶切片段的分离与回收
2.12.1从低熔点胶中回收DNA片段
2.12.2试剂盒法回收DNA片段
2.13分光光度法测定DNA浓度
2.14电泳
2.15 DNA的连接
2.16质粒DNA的转化
2.16.1快速制备E.coli的感受态细胞——CaCl2法
2.16.2转化反应
2.16.3质粒DNA的电脉冲导入
2.17 PCR扩增DNA片段
第三章 邻苯二酚产生菌株的筛选及鉴定
3.1土壤样品的采集
3.2邻苯二酚的定量测定
3.2.1 4-AAP溶液的配制
3.2.2 CAT标准溶液
3.2.3邻苯二酚的测定方法
3.2.4邻苯二酚标准曲线的绘制
3.2.5菌液中邻苯二酚的检测
3.3邻苯二酚产生菌株的筛选
3.3.1初筛
3.3.2复筛
3.4菌株的抗生素测试实验,如表3-2所示
3.5菌种鉴定
3.5.1形态学鉴定
3.5.2 16S rDNA鉴定
3.6结果与讨论
第四章 邻苯二酚产生菌株的发酵条件初步优化
4.1不同氮源对产邻苯二酚发酵的影响
4.2不同碳源对X16菌株产邻苯二酚的影响
4.3苯甲酸钠浓度对X16产邻苯二酚的影响
4.4聚蛋白胨浓度对产邻苯二酚的影响
4.5最适发酵温度
4.6最适pH
4.7在最佳发酵条件下邻苯二酚的产量
4.8讨论
第五章 产邻苯二酚菌株的固定化初步研究
5.1不同的固定化材料固定菌体发酵
5.2以海藻酸钠为固定化材料固定细胞的研究
5.2.1以海藻酸钠为固定化材料固定细胞的制作方法
5.2.2海藻酸钠浓度的选择
5.2.3不同CaCl2浓度对固定化产邻苯二酚的影响
5.2.4固定化小球中菌体的含量对产邻苯二酚的影响
5.2.5交联时间对固定化小球产邻苯二酚的影响
5.2.6发酵液pH对固定化小球产邻苯二酚的影响
5.3以聚乙烯醇为固定化材料固定细胞
5.3.1不同聚乙烯醇的浓度对固定化产邻苯二酚的影响
5.3.2聚乙烯醇中菌体的含量对产邻苯二酚的影响
5.3.3冰冻时间对固定化产邻苯二酚的影响
5.3.4pH对固定化产邻苯二酚的影响
5.4以明胶作为固定化材料固定细胞
5.4.1明胶浓度对固定化产邻苯二酚的影响
5.4.2戊二醛浓度对固定化产邻苯二酚的影响
5.5以海藻酸钠和聚乙烯醇混合材料固定细胞
5.5.1不同海藻酸钠与聚乙烯醇混合加入的比例对固定化产邻苯二酚的影响
5.5.2交联时间对固定化产邻苯二酚的影响
5.5.3pH对固定化产邻苯二酚的影响
5.6小结
第六章 邻苯二酚双加氧酶酶学特性分析
6.1酶活定义
6.2酶作用的最适pH值
6.3金属离子对酶活的影响
6.4酶的最适温度
6.5小结
第七章 总结与展望
7.1本研究的的工作总结包括
7.2本研究的后续工作包括
参考文献

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