优秀研究生学位论文题录展示

转双价基因促进植物生根及顶端优势的研究

专 业: 林木遗传育种
关键词: 基因工程 双价载体 rolB基因 PttGA20ox基因 扦插生根 顶端优势
分类号: S601  Q78
形 态: 共 88 页 约 57,640 个字 约 2.757 M内容
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内容摘要


中国有许多树种特别是一些珍贵树种,由于其自身的生理特点,有性繁殖困难,硬枝扦插生根困难,严重影响了这些优良树种的推广和应用.例如中国西北沙漠地区的胡杨、青藏高原地区的银白杨、黄土高原地区的河北杨以及华北平原的名优树种毛白杨等均属此类.利用发根农杆菌Ri质粒转化植物材料是促进植物扦插生根的有效方法,但是这些转基因植物同时也产生了比较严重的表型变异.如顶端优势削弱、节间缩短、雄性不育、早熟等.而研究结果表明,Ri质粒中的rolB基因单独表达能够诱导形成大量的毛根,而且转基因植物形态变异较少,但存在矮化现象.赤霉素Gibberellins,GAs是植物生长发育过程中一类重要的调节激素.促进植物的顶端优势是赤霉素最主要的生理功能.随着赤霉素突变体的大量发现,目前已经确认GA20-氧化酶是赤霉素代谢途径中最重要的反馈调节中心之一.该研究论文首次构建了由rolB及pttGA20ox两个基因组成的双价基因植物表达载体;并优化了烟草新基因型W38的转化受体系统,对其进行了抗生素敏感性实验,确定了最优的遗传转化条件及抗生素的筛选浓度;在首次利用高保真的pfu与pyrobest DNA聚合酶构建rolB及pttGA20ox单价基因植物表达载体的基础上,构建了由这两个基因组成的双价基因植物表达载体;利用叶盘法由农杆菌介导对烟草进行了遗传转化,通过抗生素、PCR和PCR-Southern blot等方法对转化的烟草进行了鉴定;并对获得的三种转基因烟草组培苗进行了生根、顶端优势及形态变异分析.通过转化模式植物来验证同时转化rolB及pttGA20ox两个基因促进植物生根及顶端优势的可行性.研究结果表明:烟草W38的转化受体以叶片最为合适,在筛选的MS+2.0mg/L6-BA+1.0mg/L NAA分化培养基上叶片分化的效率最高,接种叶片平均再生芽数达到15.7个;筛选烟草抗性芽的抗生素浓度以Kan 75-100mg/L或G418 50-80mg/L最佳;烟草遗传转化时菌液浓度以OD<,600>值0.5转化效率最高,分化培养基中添加200 umol/L的AS乙酰丁香酮能够使烟草的转化率达到20以上;推迟培养4-7天有利于减少假阳性苗的出现.从三种转基因烟草的功能来看:转rolB及双价基因烟草的生根时间比对照及单转单价PttGA20ox基因的烟草提前了3-5天,生根的数量及长度也有明显增强;转PttGA20ox及双价基因烟草的生长状况明显高于对照和转rolB基因烟草,其方差分析也达到了极其显著的水平;转双价基因的烟草在顶端优势及生根能力方面同时具备了转单个rolB及pttGA20ox基因烟草的特征.实验结果证明:利用基因工程技术同时转化rolB及pttGA20ox两个基因促进植物的扦插生根及顶端优势是可行的;所构建的pBin19rolB及PBI121GA单价基因表达载体及pBinrolBGApBinGR双价基因植物表达载体插入位点正确、基因功能正常.该研究内容不仅对研究植物根形态发生和植物生长发育有重要的理论意义,而且可为选育扦插生根能力强、顶端优势又不被削弱的转基因林木新品系奠定基础……

全文目录


文摘
英文文摘
本文缩略词
1引言
1.1研究目的意义
1.2Ri质粒rol基因研究进展
1.2.1发根农杆菌Ri质粒
1.2.2Ri质粒中的rol基因
1.3有关赤霉素的研究进展
1.3.1赤霉素的生物合成
1.3.2赤霉素生物合成的调节
1.3.3赤霉素反应的突变体
1.4有关GA20-氧化酶的研究进展
1.4.1 GA20-氧化酶的特征
1.4.2 GA20-氧化酶基因及其蛋白质
1.4.3 GA20-氧化酶基因表达调控
1.5研究的总体思路
2烟草遗传转化受体系统的建立
2.1材料与方法
2.1.1供试材料及试剂
2.1.2处理方法
2.1.3培养基配方
2.2结果与分析
2.2.1烟草叶片诱导愈伤实验
2.2.2叶片诱导不定芽分化培养基的筛选
2.2.3烟草生根培养基的筛选
2.3讨论
3烟草抗生素敏感性实验
3.1材料与方法
3.1.1材料与试剂
3.1.2烟草组培培养基配方
3.1.3抗生素对烟草外植体(叶片、茎段)影响的处理方法
3.1.4抗生素对农杆菌抑制效果的处理方法
3.1.5调查的项目
3.2结果与分析
3.2.1不同抗生素对烟草叶片不定芽分化的影响
3.2.2卡那霉素和头孢霉素对烟草茎段增殖的影响
3.2.3卡那霉素和头孢霉素对烟草试管苗生根的影响
3.2.4羧苄霉素和头孢霉素对农杆菌的抑菌效果
3.3讨论
4双价基因植物表达载体的构建
4.1质粒与菌株
4.2细菌培养基配方
4.3主要试剂
4.3.1DNA聚合酶介绍
4.4重要仪器
4.5载体构建的基本步骤
4.5.1质粒提取
4.5.2农杆菌感受态细胞制备
4.5.3冰冻法直接转化农杆菌
4.5.4质粒提取,PCR、酶切验证
4.5.5载体构建的反应体系
4.5.6目的片段的纯化
4.6 PCR引物序列
4.7 PCR反应程序
4.8载体构建的策略与方法
4.8.1 GH3/rolB基因表达载体的构建
4.8.2 35S/GA20ox基因表达载体的构建
4.8.3双价基因表达载体的构建
4.9构建载体的分子鉴定
4.9.1 pBin19rolB植物表达载体的鉴定
4.9.2 pBI121GA植物表达载体的鉴定
4.9.3 pBin19rolBGApBinGR植物表达载体的鉴定
4.9.4三种表达载体质粒转化农杆菌
4.9.5插入片段的测序
4.10讨论
5烟草的双价基因遗传转化
5.1材料方法与实验设计
5.1.1转化材料
5.1.2农杆菌与质粒
5.1.3农杆菌的培养与转化步骤
5.1.4影响农杆菌转化效果的实验设计
5.2结果与分析
5.2.1预培养时间对烟草叶片转化双价基因的影响
5.2.2乙酰丁香酮AS对烟草叶片转化双价基因的影响
5.2.3菌液浓度对烟草转化双价基因的影响
5.2.4推迟筛选对烟草转化双价基因的影响
5.3讨论
6转基因植株的鉴定与分子检测
6.1材料与方法
6.1.1实验材料
6.1.2实验试剂
6.2实验设计与方法
6.2.1抗生素浓度的进一步筛选
6.2.2转化材料的PCR鉴定
6.3 PCR-Southern分子杂交
6.3.1 DIG-DNA探针的制备
6.3.2转模及DNA的固定
6.3.3杂交步骤
6.3.4洗模
6.3.5显色反应
6.4结果与分析
6.4.1转基因烟草的卡那霉素鉴定
6.4.2转基因烟草的PCR鉴定
6.4.3转基因烟草的PCR-Southern鉴定
6.5讨论
7基因的功能验证及转化植株的形态变化分析
7.1材料与方法
7.1.1实验材料
7.1.2实验设计及统计方法
7.2转基因烟草的形态变化
7.2.1转rolB基因烟草的形态变化
7.2.2转pttGA20ox基因烟草的形态变化
7.2.3转双价基因烟草的形态特征
7.3转基因烟草的形态特征
7.3.1转rolB基因烟草的形态特征
7.3.2转pttGA20ox基因烟草的形态特征
7.4讨论
7.5进一步需要研究的问题
8结论
参考文献
附录1
附录2
附录3
附录4
附录5
附录6

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中图分类: > S601 > 农业科学 > 园艺 > 一般性问题 > 生物学原理
其他分类: > Q78 > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程(遗传工程)

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