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UKAV融合蛋白的表达及其生物活性研究

专 业: 生物化学与分子生物学
关键词: 蛋白表达 信号肽 杆状病毒/昆虫细胞表达系统 人膜联蛋白V 低分子量尿激酶
分类号: Q81
形 态: 共 71 页 约 46,505 个字 约 2.225 M内容
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内容摘要


人膜连蛋白V(Annexin V)是一种钙离子依赖的磷脂结合蛋白。

它对外表面含有磷脂酰丝氨酸(PS)的膜,如被活化的血小板和处于凋亡状态的细胞,具有很高的亲和力。

若Annexin V与溶栓试剂(如尿激酶)偶联,则该溶栓试剂就会被特异地带到血栓形成的部位。

本文利用昆虫细胞表达系统,分别在贴壁培养和悬浮培养的昆虫细胞中表达了融合蛋白UKAV。

同时,我们设计了两个信号肽mel和egt,并构建了两个含有该信号肽的新的供体质粒pHT mel和pHT egt。

在昆虫细胞中,这两个信号肽成功地将与之相连的UKAV分泌到胞外,并且其总表达量比非分泌表达的提高了至少一倍。

免疫印迹实验显示UKAV的分子量约为68kDa。

纤溶平板实验和膜结合实验表明融合蛋白UKAV不仅具有尿激酶的纤溶活性,而且保留了Annexin V的膜结合功能。

可见UKAV有望成为一种血栓靶向性的溶栓试剂。

UKAV在Sf9悬浮培养中的成功表达为大量获得有生物活性的该蛋白提供了条件。

另外,我们还构建了原核细胞表达载体pT7473 UKAV和pET32 UKAV,并在HMS174(DE3)中得到表达,经过Ni-NTA纯化的UKAV的尿激酶活性约为810..……

全文目录


目 录
论文摘要
综 述 部 分
第一部分 ANNEXIN V 的结构与功能
一. Annexin V的结构
二. Annexin V的生物功能
参考文献
第二部分 昆虫细胞表达系统
一. 杆状病毒/昆虫细胞表达系统的特点
二. 杆状病毒
三. Bac-to-Bac昆虫细胞表达系统
四. 杆状病毒/昆虫细胞表达系统中后加工功能的优化
五. 信号肽在杆状病毒/昆虫细胞表达系统中的应用
参考文献
实 验 部 分
第一章 材料和方法
1 材料
1.1 菌种、质粒和细胞株
1.2 主要试剂和工具酶
1.3 主要仪器
1.4 主要溶液
2 主要方法
2.1 连接
2.2 感受态细胞的制备
2.3 转化
2.4 昆虫细胞培养
2.5 昆虫细胞的冻存和复苏
2.6 Cellfectin 共转染
2.7 Western blot
2.8 纤溶平板实验
2.9 Annexin V膜结合实验
第二章 信号肽EGT和MEL的合成与新载体构建
1 前言
2 方法
2.1 合成mel和egt的部分序列
2.2 PCR延伸法合成信号肽egt和mel全序列
2.3 胶回收egt和mel的PCR产物
2.4 构建质粒pSK egt和pSK mel
2.5 构建质粒pHT egt和pHT mel
3 结果
4 讨论
参考文献
第三章 UKAV在昆虫细胞中的表达及其功能
1 前言
2 方法
2.1 质粒pHT UKAV、pHT mel-UKAV和pHT egt-UKAV的构建
2.2 重组Bacmid病毒的构建
2.3 重组Bacmid病毒的鉴定
2.4 Cellfectin共转染
2.5 UKAV在Tn细胞BTI-TN-5B1-4中的表达
2.6 UKAV在Sf9细胞中的表达
2.7 纤溶平板法测定UKAV的纤溶活性
2.8 Western Blot检测UKAV的表达
2.9 膜结合实验测定UKAV中Annexin V的活性
3 结果
3.1 重组供体质粒pHT UKAV、pHT mel-UKAV和pHT egt-UKAV构建
3.2 重组Bac UKAV、Bac mel-UKAV和Bac egt-UKAV及其病毒的获得
3.3 UKAV在Tn细胞中的表达
3.4 UKAV在Sf9细胞中的表达
3.5 比较Bac UKAV、Bac mel-UKAV和Bac egt-UKAV在Sf9细胞中的表达
3.6 重组蛋白UKAV的膜结合活性
4 讨论
参考文献
第四章 重组蛋白UKAV在原核细胞中的表达
1 方法
1.1 原核细胞表达质粒pET32 UKAV的构建
1.2 原核细胞表达质粒pMAL UKAV的构建
1.3 原核细胞表达质粒pT7473 UKAV的构建
1.4 表达质粒pMAL UKAV在BL21DE3和HMS174DE3中的表达
1.5 表达质粒pET32 UKAV和pT7473 UKAV在HMS174DE3中的表达
1.6 重组蛋白UKAV的纯化
2 结果
2.1 表达质粒pMAL UKAV、pET32 UKAV和pT7473 UKAV的示意图
2.2 表达质粒pMAL UKAV在BL21DE3和HMS174DE3中的表达
2.3 表达质粒pET32 UKAV和pT7473 UKAV在HMS174DE3中的表达
2.4 重组蛋白UKAV的纯化
小 结

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中图分类: > Q81 > 生物科学 > 生物工程学(生物技术)

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