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脱落酸(ABA)结合蛋白基因克隆、表达及其产物对ABA的特异结合

专 业: 果树学
关键词: 脱落酸结合蛋白 简并引物 RACE 酵母表达系统 亲和层析
分类号: S601
形 态: 共 63 页 约 41,265 个字 约 1.974 M内容
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内容摘要


脱落酸adscisic acid,ABA作为一种植物激素,已证实不仅在调控植物休眠、衰老和果实发育等诸多过程中起着重要的调节作用,而且,在植物对干旱、低温、盐碱等逆境胁迫的反应中起着共同调节因子的作用。

在ABA到达作用位点后,ABA应答反应的第一步是一系列的细胞信号感知和识别,其中,ABA受体对原初信号的识别起着关键的作用。

利用ABA类似物能够激活不同的应答途径,推测在植物不同的组织结构中存在多种的ABA受体。

尽管,通过遗传学、生物化学、细胞生物学方法,ABA结合蛋白的研究取得了巨大的进展。

但是,遗憾的是至今仍然还未鉴定出任何可能的ABA受体。

因此,真正意义上的ABA受体确定仍待做大量的工作。

近年来,我室利用亲和层析从蚕豆上表皮中分离出一种高亲合、高度特异性的ABA结合蛋白,并完成了对其生化特性深入分析及部分测序,且在一定程度上揭示了该蛋白与ABA的生理功能效应存在着内在的联系,这为进一步克隆ABA结合蛋白基因奠定了坚实的工作基础。

该研究是在此基础上以基于测序的部分氨基酸序列设计的简并寡核苷酸为扩增引物,结合RT-PCR和RACE技术从蚕豆幼叶中克隆得到了两个全长的cDNA序列,并建立了该基因甲醇酵母高效表达体系,通过ProBond resin镍亲和层析一次可纯化出毫克级表达蛋白,为ABA结合蛋白生理功能的进一步鉴定迈出了坚实的一步。

3′-/5′-RACE扩增片段序列分析结果表明,ABP370扩增片段的全长cDNA为3449核苷酸,其中5′非翻译区为876个核苷酸,3′非翻译区为369个核苷酸并末端带PolyA尾巴,从起始密码子ATG至终止密码子TGA,含有一个编码768个氨基酸残基的开放阅读框架2304bp;ABP640扩增片段的全长cDNA为1012核苷酸,其中5′非翻译区为88个核苷酸,3′非翻译区为144个核苷酸并末端带PolyA尾巴,从起始密码子ATG至终止密码子TAA,含有一个编码260个氨基酸残基的开放阅读框架780bp。

利用PCR技术将上述两个全长cDNA的编码区克隆到表达载体pMETα上,使之位于α因子信号肽序列的下游,6个组氨酸残基序列的上游,且与之同框,分别构建成融合蛋白分泌表达载体pMET α B/ABP2304和pMET α A/ABP780。

通过LiCI化学转化法将构建的重组质粒插入到甲醇酵母PMAD16菌株的染色体上。

筛选Ade+表型转化子,20ml BMMY摇瓶培养,用0.5%甲醇诱导表达5天后,SDS-PAGE检测结果表明:

选出的重组高效表达菌株PMAD16/pMET α B/ABP2304和PMAD16/pMET α A/ABP780都存在明显的表达特异条带,分子量分别为75kD和55kD,分别占其总蛋白的30%和10%,经过Probond Resin镍亲和层析柱都得到了纯化,其纯度都在90%以上,一次纯化分别可得到大约15mg和7mg表达蛋白,推知表达量分别高达0。

75g/L和0。

35g/L以上。

<1>H-ABA微量放射配基结合法实验结果表明,75kD纯化蛋白显示出较高的特异结合活性,55kD纯化蛋白无显著的特异结合活性……

全文目录


文摘
英文文摘
主要符号表
第一章 绪论
1.1研究目的和意义
1.2国内外研究进展
1.2.1脱落酸研究进展
1.2.2 RACE技术研究进展
1.2.3酵母表达系统研究进展
1.3研究内容和方法
第二章 脱落酸结合蛋白基因全长cDNA克隆
2.1材料
2.1.1试材
2.1.2主要化学试剂与仪器
2.2方法
2.2.1材料的获取
2.2.2总RNA提取
2.2.3 RNA产率和质量鉴定
2.2.4 mRNA纯化
2.2.5 RACE扩增
2.2.6琼脂糖凝胶纯化特异DNA片段
2.2.7目的DNA片段的克隆及鉴定
2.3结果与分析
2.3.1总RNA的提取及鉴定
2.3.2简并引物3’-RACE扩增
2.3.3简并引物扩增片段重组质粒的构建和鉴定
2.3.4简并引物扩增片段序列分析
2.3.5特异引物3-RACE及其产物的克隆、酶切鉴定和测序分析
2.3.6 5’-RACE扩增及其产物的克隆、酶切鉴定
2.3.7 5’-RACE扩增片段序列分析
2.3.8 3’/5’-RACE扩增片段拼接及其全序列分析
2.4讨论
第三脱落酸结合蛋白基因在甲醇酵母中的高效表达和鉴定
3.1材料
3.1.1主要化学试剂
3.1.2常用溶液的配置
3.1.3主要仪器设备
3.2方法
3.2.1编码区基因片段的扩增、克隆及鉴定
3.2.2表达载体的构建
3.2.3酵母感受态细胞的制备及LiCI转化
3.2.4小量表达
3.2.5分析表达
3.2.6大量表达及蛋白纯化
3.2.7 SDS-PAGE
3.2.8可溶性蛋白含量的测定
3.2.9纯化蛋白结合活性的测定
3.2.1075kD纯化蛋白动力学常数的测定
3.3结果与分析
3.3.1重组表达载体的构建
3.3.2重组表达质粒转化甲醇酵母及转化体的筛选
3.3.3重组蛋白的表达和纯化
3.3.4纯化蛋白结合活性检测
3.3.5纯化蛋白动力学常数的测定
3.4讨论
3.4.1外源基因在甲醇酵母中高效表达影响因素的分析
3.4.2基于ABP3400 cDNA编码蛋白质的亲疏水性及结构特点的预测分析
第四章 结论和建议
参考文献

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中图分类: > S601 > 农业科学 > 园艺 > 一般性问题 > 生物学原理

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