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ClC-1氯离子通道亚型的克隆及相关电生理特性的研究

专 业: 生理学
关键词: ClC-1氯离子通道 大鼠 克隆 电生理特性
分类号: Q4
形 态: 共 142 页 约 93,010 个字 约 4.449 M内容
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内容摘要


将分子生物学技术和电生理学方法有效地结合,对ClC-1在基因和功能两个水平进行研究。

具体包括:从C6细胞中克隆大鼠ClC-1的多个通道亚型的cDNA序列,揭示ClC-1基因转录的某种调节机理;在非洲爪蟾卵母细胞上异源性表达通道亚型基因并记录各通道的电流,分析其通道电流特性,揭示ClC-1的结构与功能的关系;在非洲爪蟾卵母细胞上异源性表达大鼠野生型(WT)ClC-1并记录电流,研究其电生理特性;在非洲爪蟾卵母细胞上共同表达通道亚型和野生型基因并记录电流,分析其电流特征,判断通道亚型与大鼠WT ClC-1间是否产生互相影响;建立ClC-1门控的模型;初步分析星形胶质细胞瘤中氯离子通道作用的分子学机制;基于通道电流长时间记录的需要,该文拟开发出一种替代热敏或描笔记录仪的适宜长时间离子通道电流记录的软件……

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英文摘要
1文献综述
1.1 ClC通道的生物学及相关疾病
1.1.1 Cl C通道的分类
1.1.2 ClC通道的结构和典型特性
1.1.3 ClC通道的生理作用和相关疾病
1.1.4结论
1.2 ClC通道基因转录中剪接的多样性及通道亚型
1.3 ClC-1的研究进展评价
1.4 C6细胞氯离子通道的研究现状分析
2问题提出及本文的研究目标和内容
3材料和方法
3.1细胞的培养
3.2离子通道cDNA的克隆方法
3.2.1引物设计
3.2.2细胞总mRNA的提取
3.2.3
3.2.4
3.2.5中间段的分段扩增
3.2.6 cDNA的电泳、提纯和测序
3.2.7 GenBank数据库检索与扩增片段的确认
3.2.8 cDNA质粒载体的构建和cDNA的亚克隆
3.2.9内切酶的设计与cDNA片段的连接策略
3.2.10质粒的扩增和提纯
3.3通道基因的体外转录
3.4非洲爪蟾卵母细胞的分离和培养
3.4.1爪蟾的饲养
3.4.2卵母细胞分离和培养用液体
3.4.3手术方法
3.4.4卵母细胞的分离
3.4.5卵母细胞的挑选
3.4.6卵母细胞的培养
3.5 mRNA的纳升注射与表达
3.6双电极电压钳电生理实验
3.6.1记录的条件和方法
3.6.2记录用液体
3.7数据分析的工具和方法
4结果
4.1大鼠ClC-1的五个通道亚型的cDNA序列及氨基酸序列
4.1.1 cDNA
4.1.2 cDNA近5端片段的获取
4.1.3 cDNA中间片段的获取
4.1.4片段的连接和大鼠ClC-1的5个通道亚型全长cDNA的获取
4.1.5大鼠ClC-1的5个通道亚型的氨基酸序列特征
4.1.6 cDNA的体外转录得到mRNA
4.2大鼠ClC-1五个通道亚型基因的表达和电生理特性
4.2.1 M5的通道电流与离子选择性
4.2.2 M5的稳态相对开放率对电压和氯离子浓度的依赖性
4.2.3 9-AC对M5的阻断
4.2.4 M5的通道电流对细胞外pH的依赖性
4.3大鼠WT ClC-1的通道电流与离子选择性
4.4大鼠WT ClC-1对电压和细胞外氯离子浓度的依赖性
4.5细胞外I-对大鼠WT ClC-1的阻断
4.6 9-AC对大鼠WT ClC-1的阻断
4.7细胞外pH的变化对大鼠WT ClC-1的影响
4.7.1细胞外pH的变化对通道电流的影响
4.7.2细胞外pH的变化对通道相对开放率的影响
4.7.3细胞外I-在不同pH下的阻断作用
4.7.4细胞外9-AC在不同pH下的阻断作用
4.8通道亚型与大鼠WT ClC-1共同表达的通道的基本特性
4.9 WT ClC-1门控机理模型的建立与分析
4.10通道电流长时间动态检测和记录软件的设计
5讨论
5.1 ClC-1组织分布及作用的多样性
5.2 ClC-1基因转录中剪接多样性的机理
5.3 ClC-1结构与功能关系的进一步揭示
5.4 9-AC浓度依赖性阻断机制的分析
5.5细胞外I-的浓度依赖性阻断和离子选择性原理
5.6 ClC-1存在可滴定的电压感受器
5.7 ClC-1的非均衡性的门控机理
5.8结论和展望
参考文献

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中图分类: > Q4 > 生物科学 > 生理学

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