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腺病毒介导的Rb94基因联合γ-辐射抑制人恶性肿瘤细胞生长的研究

专 业: 放射医学
关键词: Rb94基因 腺病毒表达载体 基因治疗 恶性肿瘤 细胞生长 抑瘤效应
分类号: R73
形 态: 共 73 页 约 47,815 个字 约 2.287 M内容
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内容摘要


人Rb基因视网膜母细胞瘤基因Retinoblastoma gene是最早克隆出来的人类肿瘤抑制基因<123>,Rb94基因是Rb基因的一部分,野生型pRb110蛋白N端缺失112个氨基酸残基即为pRb94蛋白。

有研究表明Rb94基因有比Rb基因更好的抑瘤效应。

本研究目的是采用INVITROGEN的pENTR1A质粒、表达载体pAd/CMV/V5-DEST构建含有Rb94基因的重组腺病毒表达载体Ad-Rb94,并观察验证其抑瘤效应。

基因治疗是当前肿瘤生物治疗的研究热点,也是以后肿瘤治疗的发展趋势。

但因其尚无突破性进展,还存在许多未能解决的问题,所以不能单独作为肿瘤治疗的一种手段。

而放疗是目前肿瘤治疗的主要方法,从机理上分析,放疗和基因治疗两者之间存在着相互增强的作用。

用本实验构建的含Rb基因的重组腺病毒表达载体转染恶性肿瘤细胞,然后联合γ-辐射,研究两者共同的作用,为临床恶性肿瘤的基因治疗和放疗的联合治疗提供实验依据。

本研究通过人的胚胎组织提取总RNA,然后利用特异引物逆转录成cDNA,以它为模板使用高保真DNA聚合酶采用PCR技术得到我们所需要的平末端的目的基因片段。

再利用INVITROGEN的pENTR1A质粒,经EcoRV、Xmn Ⅱ平末端酶切,酶切后和扩增的目的片段进行连接,并转化大肠杆菌,大量提取质粒。

用所提取的质粒和腺病毒表达载体进行LR重组构建含目的基因的腺病毒表达载体。

并把所构建的腺病毒表达载体用Pac Ⅰ进行酶切后,在脂质体的作用下转染293A细胞进行扩增。

从而制备含有目的基因的腺病毒颗粒。

本实验选择了食管癌和乳腺癌两株细胞,进行转染后观察肿瘤细胞的生长曲线、细胞周期以及细胞凋亡变化情况。

同时肿瘤细胞用重组腺病毒转染后再联合γ-辐射进行观察,观察联合作用后肿瘤细胞生长曲线、细胞周期及细胞凋亡的变化情况。

从我们所得的实验结果可知,扩增的目的片段经电泳鉴定与预期相符。

构建的pENTR1A质粒经MS Ⅱ和Nhe Ⅰ酶切鉴定连接方向正确。

构建的重组腺病毒表达载体经PCR鉴定含有目的Rb94基因。

用所得的重组腺病毒颗粒转染食管癌肿瘤细胞后,通过研究其生长曲线和细胞周期的变化情况可知,腺病毒颗粒携带的目的基因可有效的抑制食管癌细胞的生长。

转染乳腺癌细胞后,通过其生长曲线的变化发现Rb94基因对乳腺癌细胞也有一定的抑制作用。

从实验结果还可知,用重组的含Rb94基因的重组腺病毒转染肿瘤细胞后再联合γ-辐射比任何单一的处理方法效果要好。

我们所构建的重组腺病毒表达载体含有目的Rb94基因。

转染食管癌和乳腺癌的肿瘤细胞后可见明显的抑瘤效应。

因此所构建的含Rb94基因的重组腺病毒表达颗粒,可用于以后Rb94基因功能的研究。

和γ-辐射结合后两者能相互协同共同增强抑瘤效应。

增强的机理可能是射线照射后增加基因转染的效率和或促进基因的表达,另外基因转染后可增加肿瘤细胞对射线照射的敏感性。

本实验中联合作用的研究将为以后临床恶性肿瘤的治疗提供一个新的治疗方案..……

全文目录


论文说明:英文缩略词表
中文摘要
英文摘要
前言
材料与方法
1.实验材料
1.1菌株、细胞株与质粒
1.2试剂盒
1.3引物
1.4生物软件
1.5主要分子生物学试剂
1.6主要试剂
1.7主要的试剂、缓冲液和凝胶的配置
1.8主要培养基的配置
1.9细胞培养耗材
1.10胚胎人工流产
1.11主要仪器设备
2.实验方法
2.1人胚胎组织总RNA的提取
2.2逆转录成cDNA
2.3目的基因的克隆
2.4含目的基因的pENTRTM1A质粒的构建
2.5重组腺病毒表达载体的构建
2.6 293细胞培养、传代及冻存
2.7重组腺病毒颗粒的制备
2.8抑瘤实验
2.9联合抑瘤实验
实验结果
1.人胚胎组织总RNA的提取
2.RNA的定量
3.目的基因克隆电泳分析
4.pENTRTM1A质粒DNA的平末端酶切
5.构建的含目的基因pENTRTM1A质粒电泳分析
6.构建的含目的基因pENTRTM1A质粒酶切鉴定连接方向
7.重组腺病毒表达载体PCR鉴定
8.重组腺病毒转染293A细胞
9.重组腺病毒滴度的测定
10.重组腺病毒转染食管癌细胞
11.重组腺病毒转染乳腺癌细胞
12.联合抑瘤作用
讨论
1.目的基因的选择
2.联合治疗的提出
3.目的基因的克隆
4.含目的基因的pENTRTM1A质粒的构建
5.腺病毒表达载体的选择
6.含目的基因的重组腺病毒表达载体的构建
7.含目的基因的腺病毒颗粒的制备
8.目的基因抑制肿瘤细胞生长的研究
9.联合抑瘤作用
结论
参考文献
附录
综述 恶性肿瘤基因治疗和放疗相互作用的机制及联合治疗展望

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中图分类: > R73 > 医药、卫生 > 肿瘤学

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