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用不依赖培养的方法研究西湖水域微生物的多样性

专 业: 微生物学
关键词: 西湖 依赖培养法 不依赖培养法 16S rDNA TA克隆
分类号: Q93
形 态: 共 52 页 约 34,060 个字 约 1.629 M内容
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内容摘要


微生物作为物质循环和能量流动的主要参与者,在湖泊的生态系统中起着特别重要的作用。

传统上采用适当的培养基分离培养样品中的微生物,通过菌种鉴定来研究微生物群落的结构。

这种依赖培养的方法存在很大的局限性,且可培养的微生物只占微生物的1%左右:

随着分子生物学及其方法的发展,为了对西湖生态系统更全面地了解,本实验室用不依赖培养的分子生物学技术对西湖水域的微生物进行研究。

我们在西湖水域5个不同的位点和深度采集水样,通过提取水样中的总DNA,以PCR的方法分离纯化微生物的总16S rDNA,连接转化入DH5α大肠杆菌构建16S rDNA基因文库,挑选文库中的阳性克隆对其16S rDNA的部分序列进行测序,并用BLAST程序对基因库进行同源序列搜索,以DNAMAN软件构建了相关类群的系统发育树。

西湖微生物16S rDNA文库的分析表明,文库具有很高的多样性。

在进行了分子鉴定和系统分类后,结果表明在27个克隆中有9个克隆与低G+C含量的革兰氏阳性细菌相似,它们分别是Bacillussubtilis、Staphylococcussaprophyticus、 Streptococcus porcinus、Brevibacillus brevis、Bacillus sphaericus、Staphylococcuscohnii、Bacillus thusingiensis、Staphylococcus epidermidis和Bacillus simplex;6个克隆与γ-变形菌亚纲的细菌相似,它们分别是Pseudomonas alcaligenes、 Escherichia coli、Shigella sonnei、Acinetobacterjohnsonii,Pseudomonasputida和Proteusmirabilis;3个克隆与α-变形菌亚纲的细菌十分接近,它们是Sphingomonas paucimobilis、Ochrobactrum lupinu和Agrobacterium rhizogenes;2个克隆与放线茵亚纲的细菌序列十分相似,分别是Brevibacterium casei和Micrococcus luteus;3个克隆与蓝藻门的细菌十分接近,包括Leptolyngbya nodulosa和两个为未培养的蓝细菌;另外,在27个克隆中还有3个克隆是属于真核生物,它们与分别与真核生物的藻类Dinophysis norvegica、Ditylum brightwellii和Nitzschiafrustulum拥有相似的序列。

此外还有一个克隆可能为未培养微生物16S rDNA的序列..……

全文目录


摘要
前言
材料与方法
1. 样品采集
2. 主要培养基与试剂
3. 主要实验仪器
4. 样品总DNA的分离
4.1 冻融法破碎细胞
4.2 超声波破碎细胞
5. 扩增与纯化16S rDNA
5.1 PCR扩增16S rDNA
5.2 PCR产物的纯化
6. PCR产物的克隆与文库构建
6.1 连接反应
6.2 转化反应
6.3 阳性克隆的筛选与鉴定
7. 基于16S rDNA序列比较的系统发育分析
结果与分析
1. 西湖水样DNA的分离
2. 不同退火温度的PCR反应结果
3. 水样的总DNA扩增及扩增产物的纯化
4. 细菌16S rDNA文库构建与筛选
5. 分子鉴定及系统发育分析
讨论
1. 水样中总DNA的提取
2. 基于16S rDNA鉴定微生物
3. 16S dDNA的文库构建和筛选
4. 依赖培养的方法获得西湖水域微生物的多样性
5. 西湖水域16S rDNA的多样性及微生物对环境的影响
综述
西湖等城市湖泊富营养化研究与治理
参考文献

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