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人肿瘤坏死因子α30和42位氨基酸突变体结构与生物活性分析

专 业: 遗传学
关键词: 人肿瘤坏死因子 突变体 细胞凋亡 基因反应 突变体结构 生物活性分析
分类号: R78
形 态: 共 120 页 约 78,600 个字 约 3.76 M内容
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内容摘要


人肿瘤坏死因子hTNFα因其能在体内、外能特异杀伤肿瘤组织细胞而被认为是一种很有潜力的抗癌药物,然而它的毒副作用大大地限制了它在临床中的应用。

为了降低hTNFα的毒副作用,保持和增加抗肿瘤活性,研究人员对hTNFα编码区基因进行改造,从而进一步研究hTNFα突变体结构和功能的关系……

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中文摘要
英文摘要
前言
一、hTNFα基因的定点突变及其基因克隆
1、材料:
2、方法:
2.1质粒DNA的小量制备:采用碱裂解法
2.2质粒DNA的大量制备:
2.3质粒DNA的纯化:
2.4引物的设计:
2.5 PCR引导的突变原理及程序:
2.6扩增产物的检测:
2.7 PCR产物的抽提:
2.8 PCR产物及pUC19质粒DNA的酶切:
2.9 PCR扩增片段及pUC19酶切后的回收:采用透析袋回收法:
2.10基因与载体的连接:
2.11感受态细胞的制备:
2.12转化:在无菌条件下进行操作。
2.13重组质粒的筛选和鉴定:
2.14核苷酸序列测定:
3、结果:
3.1 PCR引导的定点突变:
3.2重组质粒的构建:
3.3筛选出的阳性重组质粒的核苷酸序列分析:
二、hTNFα及其突变体在大肠杆菌中的表达研究
1、材料:
2、方法:
2.1表达质粒pBV220-hTNFα的构建:
2.2重组表达质粒的筛选及鉴定:
2.3菌种的保存:
2.4外源基因的诱导表达:
2.5蛋白质的SDS-PAGE电泳:
3、结果:
3.1 pBV220-hTNFα表达质粒的构建:
3.2重组表达质粒的酶切图谱鉴定:
3.3重组蛋白的表达:
三、hTNFα及其突变体表达产物的分离纯化研究
1、材料:
2、方法:
2.1以可溶性形式表达的蛋白的分离纯化:
2.2以包涵体形式表达的蛋白的分离纯化:
3、结果:
3.1可溶性蛋白纯化结果:
3.2包涵体蛋白纯化结果:
四、rhTNFα及其突变体的蛋白样品鉴定
1、材料:
2、方法:
2.1蛋白质含量的测定:
2.2蛋白质纯度的鉴定:
2.3表达产物的Western-blot检测:
2.4 rhTNFα及其突变体表达产物构象分析:
3、结果:
3.1蛋白质的含量及纯度鉴定:
3.2 Western Blot检测:
3.3免疫沉淀结果:
五、rhTNFα及其突变体蛋白的体内、外活性检测
1、材料:
2、方法:
2.1体外活性测定:
2.2体内活性测定:
3、结果:
3.1rhTNFα及其突变体对L929细胞的细胞毒作用:
3.2 rhTNFα及其突变体的毒性比较:
3.3 rhTNFα及其突变体致肿瘤组织出血坏死效应的比较:
六、rhTNFα及其突变体刺激细胞的基因反应分析
1、材料:
2、方法:
2.1 rhTNFα及其突变体刺激L929细胞:
2.2被刺激细胞mRNA的提取:
2.3 cDNA第一链合成:
2.4 mRNA差异显示分析:
2.5 PCR产物测序:
2.6几种癌基因及程序化死亡调控相关基因的特异性差异显示分析:
3、结果:
3.1 rhTNFα及其突变体蛋白刺激细胞后的非特异性mRNA差异显示分析:
3.2差异DNA片段的序列分析:
3.3几种癌基因及程序化死亡调控相关基因的特异性mRNA差异显示分析:
讨论
小结
参考文献
论文综述
参考文献
附录

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中图分类: > R78 > 医药、卫生 > 口腔科学

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