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Wnt信号分子在大鼠脑内表达及其参与神经干细胞增殖分化调控的实验研究

专 业: 神经生物学
关键词: Wnt信号分子 糖原合酶激酶3β 神经干细胞 神经管缺陷 氯化锂 免疫组化染色
分类号: Q42
形 态: 共 70 页 约 45,850 个字 约 2.193 M内容
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内容摘要


Wnt信号通路是调控细胞生长增殖的关键途径,在胚胎发育和肿瘤发生中起着重要作用。

β-catenin是经典Wnt通路中关键的胞内效应分子,它进入细胞核后通过与LEF/TCF家族的转录因子结合,进而调控特定基因的表达。

β-catenin在胞内主要受APC-Axin-GSK-3β多蛋白复合体的调制;其中GSK-3β即糖原合酶激酶3β的主要作用是使游离的β-catenin磷酸化,使其进入泛素一蛋白酶体系统而被降解,Wnt蛋白等即通过对GSK-3β等的抑制,引起胞浆内游离β-catenin的升高而激活该途径。

在哺乳类神经系统,Wnts基因对神经管和神经嵴细胞增殖、凋亡及命运决定的调控作用几年来逐步受到关注,近年还有证据显示Wnt家族在突触形成与皮层模式的发生中也扮演了重要角色。

迄今已有研究较多是侧重于神经系统发育早期Wnt蛋白家族本身的表达与功能作用,有关Wnt信号途径下游分子β-catenin、GSK-3β等在神经系统发育特别是生后过程中的变化则报道极少,而近年已有研究显示此类分子不仅调控神经发生,同时也参与了神经系统可塑性以及神经退行性变等过程。

神经干细胞NSCs作为神经系统的原基细胞,有关其增殖及分化机制的研究是近年神经科学广受关注的焦点领域;目前对Wnt/β-catenin信号途径在NSCs增殖、分化与细胞命运决定等过程中的作用,文献报道存在较大差异,有基于基质干细胞、Wnt信号分子基因敲除及成体脑组织的观察,显示Wnt通路的激活即β-catenin信号能促进干细胞包括NSCs的增殖并阻抑其分化,而有在神经嵴细胞及皮层前体细胞的研究则报道Wnt信号主要是NSCs的一个分化诱导因子,也有认为wnt/β-catenin通路对NSCs增殖分化的调控可能具有区域与发育时段特异性;此外,有关Wnt信号途径与胚胎干细胞神经分化的关系也有不同报道;还有研究认为Wnt信号对NSCs增殖分化的调控有赖于与BMP等信号的协同。

故对此途径的深入研究不仅有助于阐明NSCs的增殖分化机制,还将可能为NSCs供源的获取及促进神经发生提供新的线索。

神经管缺陷NTD是神经管发生过程中的常见畸形,已经确定NTD发生中存在着NSCs的增殖受阻,有关Wnt信号分子在神经管和NTD发生过程中的改变及其可能作用,值得深入探讨。

本研究采用免疫组织化学染色和免疫组化双标记、细胞培养、WesternBlot等技术,结合流式细胞检测、图像分析及统计学分析等手段;在体研究了Wnt信号通路关键效应分子β-catenin在成年大鼠脑组织的表达分布及其在生后发育过程中的变化;并同时观察了Wnt信号通路GSK-3β、APC等调节分子在大鼠脑内的分布与细胞定位。

在离体培养条件下,首先检测了NSCs分化过程中上述Wnt信号分子表达的动态变化;重点观察了GSK-3β抑制剂氯化锂LiCl对NSCs细胞周期动力学等的影响以及β-catenin等信号分子的表达改变;此外还结合细胞周期等检测,比较了正常及NTD胚胎脑组织中Wnt信号分子的差异。

以探讨Wnt信号分子在脑发育、特别是NSCs增殖分化中的作用。

主要结果如下:

一、Wnt信号分子在大鼠脑组织的表达定位及其在发育过程中的变化

1.免疫组织化学结果显示β-catenin在成年大鼠脑内主要分布于皮层锥体细胞层、海马、室下层、丘脑及纹状体等区域,阳性细胞多为有突起的神经元样,在密集表达的室下区及背侧丘脑近脑室等处,β-catenin有明显的细胞核内定位;新生大鼠β-catenin在脑内呈散在分布,P3至P20β-catenin表达逐步增多,主要存在于新皮层、丘脑及室下层区域,尤其在扣带后皮质,纹状皮质,梨状前皮质等处;老年大鼠脑内β-catenin的表达分布基本与成年相似,但阳性细胞数量及强度显著低于成年。

提示β-catenin在CNS生后发育、特别是神经元功能活动中可能具有重要作用,同时也提示其与神经发生存在密切关系。

2.GSK-3β阳性细胞多为具有突起的神经元样细胞,其主要分布区域包括新皮层、海马、背内侧丘脑、小脑浦肯野细胞及脑干多个核团等,髓质区域呈现阴性。

GSK-3β、APC与β-catenin在空间分布模式上表现高度一致性。

双标记实验显示β-catenin与APC除神经元外,在部分星形胶质细胞也存在表达,而GSK-3β则主要显示神经元定位;部分β-catenin阳性细胞,特别是室下层及海马区阳性细胞还呈现与神经前体细胞标记物nestin的共存。

结果提示Wnt信号途径分子在脑内存在着密切相关的功能联系,同时在不同细胞及组织区域可能还具有其特有的生物效应,对其相关信号机制有待深入研究。

3.Westernblot结果显示β-catenin在大鼠皮层生后发育过程中存在持续表达,表达高峰主要在P3和P21两个时相,成年皮层组织内β-catenin的表达量处于相对低点。

成年皮层组织内β-catenin表达约高于同期海马;同时成年海马区β-catenin印迹呈现双带,提示其可能存在着不同的磷酸化状态。

Western印迹获得的皮层β-catenin变化与免疫组化染色结果基本一致。

二、Wnt信号分子对培养神经干细胞增殖和分化的影响

1.采用原代培养方法自胚胎14-16天大鼠皮层获得含大量细胞团的NSCs体系,细胞成悬浮球团状生长。

免疫细胞化学染色显示细胞团及散在的单个细胞多呈nestin阳性;诱导分化后鉴定显示细胞具有多向分化潜能。

本实验主要使用了传代3-4代的细胞体系。

2.应用含10%胎牛血清培养液诱导NSCs分化,WesternBlot检测了NSCs在加入胎牛血清12h、24h、48h、72h后β-catenin和GSK-3β在分化过程中的动态变化,结果显示两者存在持续表达,β-catenin表现逐渐减少趋势,而GSK-3β则逐渐增加。

提示Wnt/β-catenin通路与NSCs的分化过程密切相关,呈现了一个由活跃到逐步抑制的过程。

3.应用分离培养的NSCs体系,观察了不同浓度的GSK-3β抑制剂氯化锂1,5,10,40mmol/L处理4d后NSCs细胞周期等生物学性状改变,结果显示氯化锂能促进培养NSCs的增殖,流式细胞仪检测表现为S期、G2/M期细胞比例的增多和G1期相对减少,其效应呈现一定的剂量依赖关系;氯化锂处理后的NSCs体系细胞团块分散,呈悬浮状态生长,并能抑制血清诱导下的干细胞分化,分化细胞贴壁时间明显延长。

蛋白印迹检测显示NSCsβ-catenin在氯化锂处理后表达明显下调,表现负相关的量效关系。

提示Wnt信号途径的激活能促进培养NSCs的增殖,抑制干细胞分化,其作用可能与胞内效应分子β-catenin的增多有关。

4.采用孕鼠E7.5d腹腔内甲醇注射,获得了神经管缺陷NTD胚胎小鼠,解剖镜下E10.5d甲醇注射组鼠胚死胎明显增多,形态多样;典型的形态畸形包括颅脑顶部未闭、后脑及面部异常、脊柱或尾部有裂口及无尾或短尾等。

选用典型畸形者用于分离制备脑泡及脊髓神经组织细胞悬液,部分用于提取组织总蛋白。

5.流式细胞仪检测显示与正常对照比较,NTD鼠胚神经组织处于G0/G1期细胞百分比明显增高,处于S期细胞百分比明显降低;即呈现神经上皮G1期的阻滞。

WesternBlot检测发现NTD鼠胚神经组织中β-catenin表达明显减少,而GSK-3β表达相对增多。

提示Wnt/β-catenin通路与神经管形成密切相关并可能通过对NSCs增殖分化的调控参与了NTD的发生..……

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英文摘要
摘要
前言
第一部分 Wnt信号分子在大鼠脑组织的表达与在发育过程中的变化及其共存情况研究
第二部分 Wnt信号分子对大鼠神经干细胞增殖和分化的影响
全文总结
照片
文献综述Wnt信号通路与神经发生

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中图分类: > Q42 > 生物科学 > 生理学 > 神经生理学

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