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抗菌肽Cecropin B-人溶菌酶融合蛋白在大肠杆菌中的表达、分离纯化及检测

专 业: 生物化工
关键词: 抗菌肽 天蚕素B 人溶菌酶 融合蛋白 活性测定 大肠杆菌
分类号: Q516
形 态: 共 48 页 约 31,440 个字 约 1.504 M内容
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内容摘要


抗菌肽anti-bacterial peptides,简称ABP是生物细胞特定基因编码产生的一类小分子多肽,是宿主防御病原微生物入侵的重要分子屏障,其生成和释放是机体炎症反应的组成部分。

抗菌肽不仅对革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌具有高效广谱的杀灭能力,而且对某些病毒、真菌和原虫也具有抑杀作用;同时它对一些肿瘤细胞具有选择性杀伤作用,但对正常哺乳动物和昆虫细胞却无明显的毒副作用。

人溶菌酶human lysozyme是人体内的一种蛋白质,具有抗革兰氏阴性细菌和抗一些病毒的能力,和人体具有天然相容性。

在临床上应用时,它比其它溶菌酶更安全,没有刺激性和副作用。

本实验的目的是在构建好的抗菌肽CecropinB-人溶菌酶融合蛋白工程菌的基础上,诱导表达出目的蛋白,并对其进行分离、纯化以及活性测定,以期寻找出有利于CB-hLy表达的条件,及有效的纯化途径,从而得到一种具有更高活性的抗菌和抗病毒的重组蛋白。

抗菌肽和溶菌酶均具有很强且广谱的抗抑菌活性,这一特性为其基因工程操作带来诸多不便。

我们采用BL21DE3pLysS为宿主菌,并且将重组蛋白CB-hLV的表达视为两个阶段,前一个阶段为质粒生长阶段,采用37℃培养菌体,主要是保证质粒的稳定性和提高质粒的拷贝数;后一个阶段为重组蛋白表达阶段,待菌体生长饱和后,在25℃下低温诱导重组蛋白CB-hLy的表达。

我们除了对温度进行考察外,还研究了培养基、诱导时间等因素对蛋白表达量的影响。

实验结果表明,在TB培养基中,菌体先在37℃下生长至饱和后,再更换相同体积的新鲜TB培养基,然后转到25℃下低温诱导4h,上清中的蛋白表达量就可接近409%。

由于目的蛋白带有6xHis标签,因此可采用镍离子金属螯合层析对其进行第一步纯化,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳SDS-PAGE分析表明,其纯度约为85%,蛋白得率为1.57%。

再经第二步凝胶排阻柱层析分离后得到目的蛋白纯度约为94%,蛋白得率为0.49%。

采用琼脂渗透法对得到的纯化产物进行生物活性分析,结果表明纯化产物对金黄色葡萄球菌有良好的抑制作用..……

全文目录


文摘
英文文摘
第一部分 文献综述
第二部分 材料和方法
1.主要试剂与仪器
1.1基本试剂及生产厂家
1.2本实验所用的菌株
1.3主要仪器和厂家
1.4试剂和培养基
2.实验方法
2.1基本方法
2.2融合蛋白CB-hLy在大肠杆菌E.coil中的诱导表达
2.3融合蛋白Cecropin B-hLysozyme的纯化
2.4变性聚丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶电泳65
2.5蛋白浓度分析66
2.6融合蛋白Cecropin B-hLysozyme生物活性检测
第三部分 结果与分析
1.融合蛋白CB-hLy在大肠杆菌E.coil中的诱导表达
1.1在37℃下,BL21DE3和BL21DE3pLysS的诱导表达
1.2在25℃诱导温度下,BL21DE3和BL21DE3pLysS的诱导表达
1.3诱导前更换培养基对融合蛋白CB-hLy表达量的影响
1.4重组菌株pET32a-CB-hLy/BL21DE3pLysS诱导时机的分析
1.5诱导时间对融合蛋白CB-hLy表达量的影响
1.6融合蛋白Cecropin B-hLysozyme在重组菌株中的表达分析
2融合蛋白Cecropin B-hLysozyme的纯化
2.1 Ni2+螯合的Chelating Sepharose F.F.亲合柱色谱
2.2 Sephadex G-75凝胶排阻柱色谱
3融合蛋白CB-hLy浓度的分析
4融合蛋白CB-hLy的活性检测
第四部分 结论
1结论
2存在的主要问题
参考文献

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中图分类: > Q516 > 生物科学 > 生物化学 > 蛋白质 > 蛋白质的一级结构

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