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植物生物反应器的优化研究

专 业: 生化与分子生物学
关键词: 植物生物反应器 表达调控 N-糖基化 李痘病毒NIa蛋白酶 非典冠状病毒N蛋白
分类号: Q81  Q51
形 态: 共 131 页 约 85,805 个字 约 4.104 M内容
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内容摘要


利用植物作为生物反应器生产药用蛋白是近20年生物技术攻关的热点。

植物具有成本低、安全、蛋白具有翻译后修饰、保存方便等特点,因此与其他生物反应器大肠杆菌,酵母,昆虫细胞,动物等相比有独特的优势。

但是植物生物反应器也有自身的限制因素:

外源蛋白产量低;植物蛋白翻译后修饰系统的特异性可能对药用蛋白活性存在影响;下游分离和纯化过程中存在一定的难度。

我们的论文主要从这几个方面入手,研究如何优化植物生物反应器。

针对外源蛋白的产量低及表达难以调控的问题,我们采取了两个策略调控外源蛋白在植物中的表达。

首先,利用诱导性启动子调控蛋白在植物中的表达。

诱导性启动子在诱导处理后迅速起始下游基因的转录和表达,这使目的蛋白在短时间内大量积累而且对植物的影响降到最低。

根据我们研究室Microarray的结果,从拟南芥中克隆了5个受植物生长素auxin诱导的启动子,并验证了其中两个启动子promoterF和promoterG受到植物生长素α-萘乙酸α-NAA的诱导。

在稳定转化的拟南芥植物中,promoterF和promoterG启动子所控制的GUS蛋白的表达均受到α-萘乙酸的诱导;promoterG启动子还受组织特异性元件的调控,由promoterG启动子所驱动的GUS蛋白的表达在转基因拟南芥中具有根部特异性。

利用农杆菌注射烟草叶片方法瞬时表达重组GFP蛋白,promoterF和promoterG启动子所起始的GFP蛋白表达同样受α-萘乙酸的调控,而且存在剂量效应。

相比较而言,这两个启动子的转录效率都比组成型的强35S启动子低,但是promoterG启动子的转录效率比promoterF启动子的要高。

其次,通过抑制转录后基因沉默PTGS而增强外源蛋白的表达。

来源于番茄丛矮病毒tomato bushy stunt virus,TBSV的p19蛋白已被报道可以有效抑制PTGS而增强GFP蛋白在植物中的瞬时表达。

在农杆菌注射烟草叶片的实验中,p19蛋白可以使SARS-CoV N蛋白的表达量在每克鲜重叶片中达到79 μg,比没有p19蛋白的对照提高了4倍。

用含有SARS-Cov N蛋白的植物提取液对小鼠进行腹腔注射免疫,在小鼠血清中能检测到N蛋白特异的抗体,同时小鼠脾中的细胞因子的表达水平产生了变化,浼明了植物表达的SARS-CoV N蛋白在小鼠中引起了特异的体液免疫和细胞免疫。

许多重要的药用蛋白必须经过前体剪切和糖基化等翻译后修饰才能成为有活性的蛋白,而且药用蛋白可能会因为N-糖基化修饰的变化而丧失生物活性。

植物与哺乳动物的N-糖基化系统基本相同,但也存在一些差异,其中植物糖蛋白特异的β-1,2-木糖和α-1,3-岩藻糖糖基具有免疫原性,可能会在动物体中引起过敏反应。

我们设计了RNAi载体转化植物来沉默这两个糖基对应的糖基转移酶基因。

我们从烟草BY2细胞Nicotiana tobacum L.cv.Bright Yellow 2中扩增出未曾报道的烟草β-1,2-木糖转移酶的基因片断和α-1,3-岩藻糖转移酶的基因片段,这两个片断与其它植物物种的糖基转移酶基因的相应区域具有很高的同源性。

利用这两个片断分别构建含有内含子的自身互补的发夹RNA,并克隆到诱导性型载体和组成型载体中。

烟草β-1,2-木糖转移酶基因的RNAi片断在稳定转化的烟草BY2细胞中诱导转录后不能使β-1,2-木糖糖基的含量明显下降;但是烟草α-1,3-岩藻糖转移酶基因的RNAi片断在稳定转化的烟草BY2细胞中诱导转录后可以能α-1,3-岩藻糖糖基的含量明显下降。

β-1,2-木糖转移酶基因和α-1,3-岩藻糖转移酶基因的RNAi片断在烟草Nicotiana tobacum中瞬时转录后可以降低注射的烟草叶片中β-1,2-木糖和α-1,3-岩藻糖的含量。

植物表达的外源蛋白的分离和纯化也是植物生物反应器的难题之一。

利用融合蛋白的方式在植物中表达目的蛋白不但可简化外源蛋白的检测,而且可以大大降低下游纯化和分离的成本。

但是为了避免融合短肽对目的蛋白结构和功能的影响,通常会在纯化的同时或者之后去除融合短肽。

特异性蛋白酶可以识别由几个特定氨基酸组成的位点而进行切割,是去除融合短肽的有效工具。

烟草花叶病毒tobacco etch virus,TEVNIa蛋白酶由于对识别位点的高严谨性和高酶切活性而得到广泛的应用。

我们发现李痘病毒Plum pox virus,PPVNIa蛋白酶也可以在体外对含有其识别位点的融合蛋白进行高效特异的切割。

我们在大肠杆菌中表达和纯化了重组的PPV NIa蛋白酶,并在体外切割含有PPV NIa蛋白酶识别位点F的重组GFP或者SARS-CoV N蛋白。

我们还分析了可能影响重组PPV NIa蛋白酶酶切效率的因素温度、离子强度、蛋白酶抑制剂、去垢剂和变性剂,优化了重组PPV NIa蛋白酶的酶切反应条件。

重组的PPV NIa蛋白酶不存在自我降解现象,而野生型的TEv NIa蛋白酶则存在自我降解而失活的现象,这证明PPV NIa蛋白酶具有更长的半衰期。

另外,我们利用PPV NIa蛋白酶在大肠杆菌巾可以作为异源多聚蛋白的一个组分进行切割的特性,构建了一个快速检测蛋白相互作用的系统..……

全文目录


文摘
英文文摘
第1章 引言
1.1植物生物反应器的应用现状
1.2植物生物反应器的存在问题分析
1.3本研究的外源蛋白选择
1.4论文目标
第2章 材料与方法
2.1外源蛋白在植物生物反应器中的表达调控
2.2植物系统的N-糖基化改造
2.3蛋白酶在融合蛋白分离及纯化过程中的应用
第3章 结果
3.1外源蛋白在植物生物反应器中的表达调控
3.2植物系统的N-糖基化改造
3.3蛋白酶在重组蛋白分离及纯化过程中的应用
第4章 讨论部分
4.1外源蛋白在植物生物反应器中的表达调控
4.2植物系统的N-糖基化改造
4.3蛋白酶在重组蛋白分离及纯化过程中的应用
结语
参考文献
附录

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中图分类: > Q81 > 生物科学 > 生物工程学(生物技术)
其他分类: > Q51 > 生物科学 > 生物化学 > 蛋白质

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