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妥布霉素的生物合成基因簇中6-脱氢酶基因的研究

专 业: 微生物与生化药学
关键词: 黑暗链霉菌 3 -脱氧-氨甲酰卡那霉素C 6 -脱氢酶 基因阻断与互补
分类号: R971
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内容摘要


黑暗链霉菌H6(Streptomyces tenebrarius H6)产生三种抗生素:安普霉素、氨甲酰妥布霉素和少量氨甲酰卡那霉素B。

为研究妥布霉素生物合成基因簇中tacB基因的功能,利用PCR扩增获得tacB及其上下游部分序列,SaiI酶切剔除了基因内部部分序列,构建基因阻断载体pHZ132-△tacB,经接合转移导入黑暗链霉菌H6中。

首先筛选到红霉素抗性的单交换菌株,无药传代后,点种筛选到红霉素敏感的菌株,进一步利用PCR、测序筛选到双交换的tacB基因阻断株S.tenebrarius tacB~-。

经发酵产物分析,阻断变株合成一种新的抗生素组分。

通过离子交换的方法,提取阻断株所产生的新组分,MS、NMR分析确定该新组分为3 -脱氧-氨甲酰卡那霉素C。

为排除基因阻断导致的极性效应,对阻断株进行互补实验。

完整的tacB基因由汞抗性基因启动子(PmerR)启动,构建基因互补质粒pSET1..……

全文目录


摘要
英文摘要
前言
实验材料
实验方法
1.大肠杆菌质粒DNA小量提取
2.大肠杆菌质粒DNA大量提取
3.链霉菌质粒DNA的提取
4.链霉菌总DNA的提取
5.大肠杆菌DH-5α感受态细胞的制备
6.质粒DNA转化大肠杆菌
7.DNA酶切和连接
8.DNA电泳和片断回收
9.PCR反立
10.接合转移试验
11.黑暗链霉菌发酵及检测操作的实验方法
11.1发酵流程
11.2抗生素组分检测
12.抗生素的提取与纯化
12.1发酵液的预处理
12.2样品的提取
13.HPLC-ELSD分析
结果与讨论
第一部分 tacB阻断株的获得及发酵组分分析
1.阻断载体的构建
2.接合转移实验
3.单交换基因阻断菌株的获得
4.基因阻断菌株体内游离质粒的考察
5.双交换基因阻断菌株的获得
6.阻断株S.tenebrarius tacB-发酵组分分析
7.讨论
第二部分 阻断株S.tenebrarius tacB-产生的新组分的分离、纯化与结构确定
1.新组分的分离纯化
2.新组分的MS分析
3.新组分的NMR分析
4.讨论
第三部分 阻断株S.tenebrarius tacB-的互补实验
1.互补质粒的构建
2.接合转移实验
3.接合子分子水平验证
4.接合子的发酵组分分析
5.S.tenebrarius tacB--tacB发酵产物的提取及HPLC-ELSD检测
6.讨论
结论
参考文献
附录

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中图分类: > R971 > 医药、卫生 > 药学 > 药品 > 神经系统药物

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