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农杆菌介导的稻瘟病菌转化及致病突变体的筛选

专 业: 植物病理学
关键词: 稻瘟病菌 根癌农杆菌介导转化 插入突变 致病缺陷突变体
分类号: S4
形 态: 共 69 页 约 45,195 个字 约 2.162 M内容
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内容摘要


稻瘟病菌Magnaporthe grisea可以引起水稻上的重要病害—稻瘟病。

了解M.grisea的致病分子机理不仅对防治稻瘟病具有重要的意义,而且它作为一个理想的研究体系对了解其他植物病原真菌与寄主的相互作用也有重要的意义。

分离和鉴定稻瘟病菌的致病相关基因,是达到这一目标的关键所在。

DNA插入突变是标记、分离功能基因的有效途径之一,ATMT是丝状真菌遗传转化的一个的新的技术,具有转化效率高、成本低,操作方便和重复性好多重优点。

我们用含有潮霉素B磷酸转移酶基因双元载体的农杆菌介导稻瘟病菌Guyll转化,转化效率达每10~6个分生孢子>300个转化子,并得到了1114个转化子。

通过继代培养和PCR检测,证明插入到稻瘟病菌基因组中的潮霉素抗性基因可稳定遗传。

用感病大麦叶片离体接种的方法快速测定稻瘟病菌转化子的致病性,鉴定了致病性下降或缺陷的4个突变体,它们分别是A1-134,A1-452,A2-1-8和A1-3-6。

进一步的表型分析发现:1这些突变体对感病水稻品种的致病性也有不同程度的下降;2A1-134突变体的产孢量显著下降,仅为野生菌株的7.8,孢子形态为圆球形,只有一个分隔,而A1-..……

全文目录


摘要
一 文献综述
1.1 稻瘟病菌侵染循环
1.2 稻瘟病菌株的多样性
1.3 致病性变异的原因
1.4 稻瘟病菌功能基因的研究
1.5 稻瘟病菌的突变体研究途径
1.5.1 物理诱变
1.5.2 化学诱变
1.5.3 外源DNA插入突变
1.6 稻瘟病菌附着胞的穿透与扩展以及病斑形成
1.6.1 附着胞的穿透
1.6.2 侵入后生长及病斑形成
1.7 根癌农杆菌介导的转化Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, ATMT
1.7.1 ATMT在丝状真菌上应用的研究现状
1.7.2 根癌农杆菌介导真菌遗传转化的机理
1.7.3 根癌农杆菌介导丝状真菌转化的一般方法
1.7.4 根癌农杆菌介导的丝状真菌转化的特点
1.8 本研究的实验目的和内容
二 材料与方法
2.1 菌株、质粒、试剂及培养条件
2.1.1 菌株
2.1.2 质粒
2.1.3 供试植物
2.1.4 试剂及来源
2.1.5 菌种保存及培养条件
2.2 培养基的配制
2.3 常规分子生物学实验技术
2.3.1 PCR反应
2.3.2 酶切反应
2.3.3 DNA的琼脂糖电泳
2.3.4 DNA片段的凝胶回收
2.3.5 酶切片段的去磷酸化CIAP
2.3.6 连接反应
2.3.7 大肠杆菌感受态细胞制备
2.3.8 大肠杆菌转化
2.3.9 提取质粒DNA
2.4 农杆菌的冻融法转化
2.5 农杆菌的电击转化
2.5.1 农杆菌的电击感受态制备
2.5.2 农杆菌的电击转化
2.6 稻瘟病菌的T-DNA转化
2.7 转化子DNA提取与分析
2.7.1 CTAB法提取基因组DNA
2.7.2 PCR验证
2.8 突变体的表型分析
2.8.1 生长速度与产孢量
2.8.2 孢子萌发与附着孢形成观察
2.8.3 致病性测定
2.9 突变体A1-134的T-DNA侧翼基因组序列扩增
2.9.1 高效TAIL-PCR引物
2.9.2 高效TAIL-PCR反应条件
2.10 T-DNA标记的基因分析
三 结果与分析
3.1 稻瘟病菌的T-DNA转化
3.1.1 诱导培养
3.1.2 选择培养基中抗生素的选择
3.1.3 转化效率
3.2 突变体的生物学特性
3.2.1 致病性测定
3.2.2 突变体表型分析
3.3 突变体A1-134的PCR检测
3.4 突变体A1-134的T-DNA侧翼序列扩增及克隆
3.4.1 高效TAIL-PCR扩增突变体A1-134的左翼序列
3.4.2 突变体A1-134的插入基因库克隆
3.4.3 A1-134突变体T-DNA标记基因信息生物学分析
3.5 突变体A1-134互补载体构建
四、讨论
参考文献

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中图分类: > S4 > 农业科学 > 植物保护

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